王咪咪, 崔杰峰

王咪咪, 崔杰峰. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所 上海市 200032

0 引言

從細(xì)胞形態(tài)維持到組織發(fā)育驅(qū)動, 力學(xué)信號的影響無處不在. 與在正常組織發(fā)揮的生理調(diào)節(jié)不同, 力學(xué)信號在實(shí)體腫瘤發(fā)生、生長、侵襲轉(zhuǎn)移等惡性進(jìn)展中起著不可忽視的促進(jìn)作用[1-3]. 生物力學(xué)信號常來自于基質(zhì)硬度、擠壓力、牽拉力、流體剪切力等力學(xué)刺激, 上述力學(xué)刺激可顯著改變細(xì)胞生物學(xué)功能, 同時細(xì)胞亦會通過改造胞外微環(huán)境以適應(yīng)周邊力學(xué)壓力, 以此形成一個反饋循環(huán), 而闡明生物力學(xué)調(diào)控反饋循環(huán)機(jī)制, 尤其是細(xì)胞如何感應(yīng)力學(xué)信號無疑為疾病干預(yù)提供了新的研究方向.

將機(jī)械力學(xué)信號轉(zhuǎn)化為生物信號或電信號的過程稱為生物力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo). 力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑常分為三類: 細(xì)胞膜受體和表面的離子通道, 細(xì)胞骨架(應(yīng)力纖維、微管等), 核骨架和細(xì)胞骨架連接體復(fù)合體[1]. 離子通道為包埋在質(zhì)膜中的蛋白質(zhì)孔道. 當(dāng)通道受力學(xué)信號刺激打開時, 離子沿電化學(xué)梯度方向從孔道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部, 不需要ATP水解提供能量. Piezo1通道就是典型的機(jī)械敏感性離子通道[4,5].

1 Piezo1結(jié)構(gòu)與功能, 及其通道活化影響因素

Piezo1是機(jī)械力敏感性離子通道Piezo家族成員之一,2010年由Bertrand Coste團(tuán)隊發(fā)現(xiàn), 并以希臘文“π?εση”(p?esi)命名-意為壓力[5]. 該團(tuán)隊使用鈣離子通道阻滯劑釕紅證實(shí)Piezo1蛋白可在細(xì)胞膜表面組成特定電導(dǎo)的孔狀通道, 非選擇地傳導(dǎo)陽離子[4]. Syeda等[6]則明確力學(xué)信號直接調(diào)節(jié)Piezo1通道開關(guān). Piezo1可感應(yīng)生理病理過程中多種機(jī)械力刺激, 包括脈管血壓[7,8]、流體剪切應(yīng)力[9]、骨骼系統(tǒng)微重力[10]、紅細(xì)胞內(nèi)滲透壓[11-13]、胞外基質(zhì)硬度[14], 觸覺、本體感覺[15]等.

人Piezo1基因位于染色體16, 其蛋白由2521個氨基酸組成. 小鼠PIEZO1基因與人類高度同源. 研究者利用蛋白質(zhì)工程、X射線晶體學(xué)、單粒子冷凍電子顯微鏡及活細(xì)胞免疫染色等多種技術(shù), 成功揭示了小鼠Piezo1通道結(jié)構(gòu)[4,16,17]. 小鼠Piezo1蛋白由2547個氨基酸組成[16], 具有獨(dú)特的38跨膜螺旋拓?fù)浣Y(jié)構(gòu). 三個Piezo1蛋白組裝成一個三葉螺旋槳狀的功能結(jié)構(gòu), 其中, 側(cè)邊螺旋槳葉片是力學(xué)信號感應(yīng)關(guān)鍵區(qū)域[17]. 該蛋白結(jié)構(gòu)的解析為理解Piezo1離子傳導(dǎo)和門控機(jī)制提供了基礎(chǔ).

Piezo1在機(jī)械力調(diào)控下可切換封閉與開放構(gòu)象, 以控制不同種類(離子選擇性)及流量(電導(dǎo))的離子通過通道. Piezo1被瞬時性力學(xué)信號激活后, 能在50-100 ms內(nèi)迅速完全失活[18]. 同時, 特定情況下也展現(xiàn)慢失活或無失活狀態(tài)[19,20]. 多數(shù)研究以瞬時機(jī)械力學(xué)信號解析通道特征, 而對持續(xù)機(jī)械力學(xué)信號刺激研究較少.

機(jī)械力敏感性離子通道的門控機(jī)制包括“橫向膜張力”模型(來自脂質(zhì)雙分子層的力)和“系繩彈簧模型”(來自細(xì)胞骨架的力), 分別對應(yīng)“從外到內(nèi)”和“從內(nèi)到外”兩種力學(xué)信號傳導(dǎo)方向[21,22]. 因此, 影響Piezo1門控的因素主要包括細(xì)胞膜張力、硬度, 細(xì)胞膜骨架蛋白, 及與Piezo1相互作用的其他通道或蛋白.

GsMTx4和Yoda1是Piezo1通道常用拮抗劑和激動劑. GsMTx4為蜘蛛毒液中提取的一種肽毒素, 可阻斷牽拉激活性通道[23]. GsMTx4能插入脂質(zhì)雙分子層抑制各種陽離子機(jī)械敏感通道, 包括Piezo1、雙孔鉀離子通道家族成員KCNK2(potassium two pore domain channel subfamily K member 2, KCNK2)、和大電導(dǎo)機(jī)械敏感性離子通道(mechanosensitive channel of large conductance,MscL)[24], 通過調(diào)節(jié)局部膜張力而非直接作用Piezo1蛋白而發(fā)揮作用[23]. Yoda1是Piezo1第一種化學(xué)活化劑.Yoda1增強(qiáng)Piezo1機(jī)械敏感性并減慢失活而充當(dāng)門控修飾劑. 其可直接與Piezo1蛋白結(jié)合, 在沒有外在機(jī)械力刺激情況下激活通道[25]. 此外, Jedi1和Jedi2兩種新型低親和力水溶性化學(xué)激活劑, 可特異性激活Piezo1; 比Yoda1介導(dǎo)的電流呈現(xiàn)更快爆發(fā)和衰變; Jedi1和Yoda1激活Piezo1位點(diǎn)不同, 可協(xié)同應(yīng)用[26].

2 Piezo1感應(yīng)力學(xué)信號調(diào)控腫瘤惡性特征研究進(jìn)展

腫瘤組織與正常組織的硬度力學(xué)特征明顯不同, 臨床許多常見實(shí)體腫瘤也多依據(jù)上述物理特征進(jìn)行鑒別與診斷, 如肝細(xì)胞肝癌[27]、胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌[28,29]和乳腺癌[30-32]等. 本課題組前期相繼報道基質(zhì)硬度增加調(diào)控肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的系列新機(jī)制, 包括獨(dú)立誘導(dǎo)肝癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的發(fā)生[33]; 加速肝癌肺預(yù)轉(zhuǎn)移龕形成[34-36]; 上調(diào)肝癌細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)[37]和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)表達(dá)[38], 促進(jìn)腫瘤血管新生, 說明硬度力學(xué)信號在增強(qiáng)肝癌細(xì)胞惡性特征方面發(fā)揮重要作用. 而機(jī)械敏感性離子通道蛋白Piezo1在胃腸道系統(tǒng)中均有表達(dá), 包括胃、小腸、結(jié)腸組織等[5], 作為傳遞力學(xué)信號的新途徑, 其在消化系統(tǒng)腫瘤癌變、生長、侵襲轉(zhuǎn)移等相關(guān)惡性特征調(diào)控中同樣發(fā)揮作用.

2.1 Piezo1介導(dǎo)力學(xué)信號誘導(dǎo)細(xì)胞癌變 部分具有正常生理功能的健康細(xì)胞也攜帶致癌突變基因[39,40]. 單個基因的突變可增加癌變易感性, 但致癌基因并非驅(qū)動細(xì)胞癌變的唯一因素, 細(xì)胞與其周邊微環(huán)境交流也是重要決定因素, 包括微環(huán)境中生物力學(xué)因素.

在小鼠和人乳腺管腔分化細(xì)胞中轉(zhuǎn)染編碼HER2的慢病毒, 使其具有癌變易感性, 細(xì)胞及動物實(shí)驗(yàn)顯示HER2+的管腔細(xì)胞在高基質(zhì)硬度條件下能成瘤[41]. 表明力學(xué)信號的增強(qiáng)對癌基因啟動、腫瘤發(fā)生至關(guān)重要. 正常組織基質(zhì)偏軟, 在一定程度上削弱癌基因驅(qū)動力. 研究顯示, 在Apc突變小鼠結(jié)腸, 微環(huán)境壓力可激活結(jié)腸上皮細(xì)胞Ret信號, 誘導(dǎo)β-catenin Y654位點(diǎn)磷酸化, 阻斷其與E-cadherin結(jié)合, 使其從粘附連接處釋放[42], 在胞質(zhì)累積發(fā)生核轉(zhuǎn)位, 促進(jìn)相關(guān)靶基因表達(dá)增加, 進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)腸腫瘤惡變[43].

感應(yīng)機(jī)械力學(xué)信號Piezo1的發(fā)現(xiàn), 為力學(xué)信號調(diào)控細(xì)胞癌變機(jī)制研究與源頭干預(yù)提供了基礎(chǔ). Gudipaty等[44]在犬腎上皮細(xì)胞(Madin-Darby canine kidney, MDCK)、人結(jié)腸上皮細(xì)胞、斑馬魚表皮細(xì)胞進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn)Piezo1可介導(dǎo)牽拉力促進(jìn)上皮細(xì)胞分裂, 同時又可介導(dǎo)擠壓力在細(xì)胞密度達(dá)到一定程度后, 通過1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, S1P), 誘導(dǎo)Rho介導(dǎo)的肌動球蛋白環(huán)收縮, 從而在細(xì)胞密度最高的地方將活細(xì)胞擠出,最終誘導(dǎo)離巢細(xì)胞死亡[45]. 上述過程保持細(xì)胞數(shù)量維持上皮穩(wěn)態(tài), 而破壞Piezo1力學(xué)信號傳導(dǎo)會阻止活細(xì)胞擠出, 導(dǎo)致上皮細(xì)胞團(tuán)塊大量堆積, 說明Piezo1介導(dǎo)力學(xué)信號在癌變發(fā)生尤其是上皮類腫瘤癌變中扮演重要角色. Liu等[46]用DEN誘發(fā)Piezo1+/-小鼠與Piezo1+/+小鼠癌變, 發(fā)現(xiàn)Piezo1+/-小鼠的腫瘤大小和惡化程度明顯低于Piezo1+/+小鼠, 同樣說明Piezo1與細(xì)胞癌變密切相關(guān).

2.2 Piezo1介導(dǎo)力學(xué)信號調(diào)控細(xì)胞增殖、周期與凋亡

研究顯示牽拉力可激活MDCK上皮細(xì)胞Piezo1通道, 促進(jìn)鈣離子內(nèi)流, 激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2, ERK1/2)通路, 增加細(xì)胞Cyclin B表達(dá), 促進(jìn)上皮細(xì)胞從G2期進(jìn)入有絲分裂, 從而加速細(xì)胞增殖[44]. 而擠壓力激活Piezo1通道, 則誘導(dǎo)上皮細(xì)胞失巢凋亡[45]. 說明Piezo1對細(xì)胞增殖、凋亡的影響取決于機(jī)械力種類和方向. 然而, Piezo1對不同種類的細(xì)胞增殖和周期的影響也不同, 如Piezo1敲除可顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長, 但對正常腦組織細(xì)胞無影響[14]. 在前列腺癌[47]、胃癌[48]、肝細(xì)胞肝癌[46]中, 下調(diào)Piezo1抑制腫瘤細(xì)胞增殖, 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡. 而Yoda1可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[49]. 此外, 不論藥物抑制還是基因干預(yù)Piezo1表達(dá)與活化都不影響胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌生長[50]. 因此, 脫離細(xì)胞類型及細(xì)胞力學(xué)環(huán)境討論P(yáng)iezo1功能是不可取的, 但目前多數(shù)研究將Piezo1作為原癌基因或抑癌基因?qū)ζ湎抡{(diào)或過表達(dá), 忽略力學(xué)信號對Piezo1活性影響, 且機(jī)械力對細(xì)胞增殖影響并非線性, 而當(dāng)機(jī)械力刺激超過一定范圍后, 細(xì)胞增殖速率隨之降低[51,52], 甚至?xí)霈F(xiàn)損傷及死亡, 此時藥物抑制Piezo1通道, 可保護(hù)細(xì)胞免于病理水平機(jī)械力刺激的影響[53-55].

2.3 Piezo1介導(dǎo)力學(xué)信號影響腫瘤細(xì)胞干性 力學(xué)信號可顯著影響腫瘤細(xì)胞干性特征. Liu等[56]用21 kPa, 70 kPa,105 kPa三種不同硬度水平的海藻酸鹽凝膠, 對頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng), 發(fā)現(xiàn)70 kPa硬度培養(yǎng)體系中,癌細(xì)胞干性標(biāo)記物表達(dá)最高, 成瘤能力和藥物耐受性最強(qiáng). 本課題組前期研究也顯示基質(zhì)硬度增加增強(qiáng)肝癌細(xì)胞干性特征[57], 說明適宜的基質(zhì)硬度環(huán)境的確可影響腫瘤細(xì)胞干性. Piezo1介導(dǎo)力學(xué)信號調(diào)控腫瘤細(xì)胞干性研究尚未見報道, 但已有研究顯示: 隨年齡增加導(dǎo)致大腦硬度增加, 通過激活Piezo1降低大腦多功能干細(xì)胞活性, 抑制Piezo1能夠抵消衰老中樞神經(jīng)系統(tǒng)中力學(xué)信號對多功能干細(xì)胞干性的削弱[58]; 果蠅胃擴(kuò)張可通過激活Piezo1促進(jìn)腸內(nèi)分泌前體細(xì)胞自我增殖和分化[59]. 上述結(jié)果均為Piezo1介導(dǎo)力學(xué)信號影響腫瘤細(xì)胞干性研究提供了啟示.

2.4 Piezo1介導(dǎo)力學(xué)信號影響腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移 腫瘤細(xì)胞從原發(fā)瘤脫落、基質(zhì)侵襲、進(jìn)入血管、血管免疫逃逸、出血管、定植擴(kuò)增形成轉(zhuǎn)移灶的整個轉(zhuǎn)移過程中,都會感應(yīng)到不同機(jī)械力刺激, 包括基質(zhì)力學(xué)信號和流體力學(xué)信號[60,61]. 而Piezo1作為機(jī)械敏感性離子通道可以感應(yīng)多種種類的力學(xué)信號刺激. 因此, 通過Piezo1研究力學(xué)信號對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的影響具有代表性.

Piezo1表達(dá)與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān). Piezo1蛋白與三葉因子1(trefoil factor 1, TFF1)結(jié)合, 能夠增強(qiáng)胃癌細(xì)胞運(yùn)動性[62]; 敲低Piezo1可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞內(nèi)GTPRac1積累, 降低細(xì)胞運(yùn)動能力[48]. Piezo1在結(jié)腸癌組織中高表達(dá), 體外Piezo1過表達(dá)或者Yoda1刺激可通過線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochondrial calcium uniporter, MCU)-缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)-VEGF通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移; 沉默Piezo1則相反[49].腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移需要具備在限制性空間遷移的能力, 細(xì)胞從狹窄通道穿行需要鈣離子內(nèi)流, 而Piezo1激活可誘發(fā)大量鈣離子內(nèi)流. 研究顯示, 下調(diào)倉鼠卵巢細(xì)胞CHO中Piezo1表達(dá), 對其在非限制空間的遷移速度無明顯影響,但明顯降低了細(xì)胞在限制空間的遷移速度[63]. 細(xì)胞核是細(xì)胞中最硬的結(jié)構(gòu), 當(dāng)通過的周邊基質(zhì)或孔道硬度高于核硬度時, 細(xì)胞核需要變形以適應(yīng)遷移通道尺寸, 才能順利通過通道. 細(xì)胞核大小、可塑性是腫瘤細(xì)胞在限制性空間遷移的重要限制因素[64]. 基質(zhì)硬度影響細(xì)胞核形狀, 在硬的基質(zhì)表面生長的細(xì)胞呈現(xiàn)較薄且伸展的細(xì)胞核, 而在軟基質(zhì)表面生長細(xì)胞的細(xì)胞核相對更厚、延展面積小[65]. 胞外基質(zhì)硬度改變核膜硬度、染色體解聚、小葉化, 使細(xì)胞更易于向周圍基質(zhì)浸潤[66]. 此外, 流體剪切應(yīng)力激活Piezo1通道, 鈣離子內(nèi)流, 介導(dǎo)肌動蛋白收縮, 使細(xì)胞核縮小[67]. 上述結(jié)果提示空間限制、牽拉力、流體剪切應(yīng)力等, 均可激活Piezo1通道, 調(diào)控細(xì)胞核大小, 影響腫瘤細(xì)胞遷移.

2.5 Piezo1介導(dǎo)力學(xué)信號影響腫瘤血管新生 Piezo1為內(nèi)皮細(xì)胞剪切應(yīng)力感受器, 是胚胎發(fā)育及生理過程中血管發(fā)育形成、維持結(jié)構(gòu)功能的決定因素[9,68-71]. 小鼠Piezo1全部敲除或內(nèi)皮特異性破壞會嚴(yán)重擾亂脈管系統(tǒng)發(fā)育而致胚胎死亡[9,70]. 而Yoda1激活Piezo1可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)芽及管腔形成[69]. 因此, Piezo1與腫瘤血管新生、功能、完整性等之間存在密切關(guān)系, 但相關(guān)研究目前較少. Piezo1在結(jié)腸癌組織中高表達(dá), 與差的預(yù)后密切相關(guān). 沉默Piezo1表達(dá)可抑制HIF-1α和VEGF的表達(dá). 而VEGF是腫瘤血管新生的強(qiáng)誘導(dǎo)因子[49]. 我們研究數(shù)據(jù)也顯示, 基質(zhì)硬度激活肝癌細(xì)胞Piezo1通道增加鈣離子內(nèi)流, 促進(jìn)促血管因子表達(dá), 誘導(dǎo)肝癌血管新生(未發(fā)表結(jié)果).

3 Piezo1感應(yīng)力學(xué)信號調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境

腫瘤免疫微環(huán)境重塑可顯著影響腫瘤惡性特征及其進(jìn)展, Piezo1是否會通過誘導(dǎo)腫瘤免疫抑制微環(huán)境形成促進(jìn)腫瘤進(jìn)展? 研究顯示, Piezo1低表達(dá)胰腺導(dǎo)管腺癌患者5年存活率為20%, 而Piezo1高表達(dá)患者則未發(fā)現(xiàn)長期存活, 利用小鼠胰腺導(dǎo)管腺癌原位模型, 發(fā)現(xiàn)GsMTx4可有效地抑制腫瘤生長, 且使腫瘤組織中髓系抑制細(xì)胞明顯減少, Yoda1則增加腫瘤中髓系抑制細(xì)胞的數(shù)量; 髓系細(xì)胞經(jīng)Piezo1感知機(jī)械壓力, 抑制組蛋白去乙酰基酶2(histone deacetylase 2, HDAC2), 減少視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因(retinoblastomal transcriptional corepressor 1,Rb1)表達(dá),而使髓系細(xì)胞大量擴(kuò)增, 抑制腫瘤T細(xì)胞活化, 形成腫瘤免疫抑制微環(huán)境, 促進(jìn)腫瘤發(fā)展[50]. 此外, Piezo1可介導(dǎo)周期性靜水壓刺激肺單核細(xì)胞內(nèi)HIF-1α聚集, 誘導(dǎo)促炎表型形成[72]; 高基質(zhì)硬度力學(xué)信號也可激活Piezo1, 加速樹突狀細(xì)胞糖酵解速率, 增強(qiáng)促炎功能[73]; 力學(xué)信號感應(yīng)蛋白Piezo1也可參與T細(xì)胞激活[74]. 因此, Piezo1在機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫方面都具有調(diào)節(jié)作用.

Piezo1離子通道也可被超聲激活, 介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流, 激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶, 去磷酸化轉(zhuǎn)錄因子活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT), 促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位, 進(jìn)而激活NFAT反應(yīng)元件, 驅(qū)動設(shè)計的靶基因表達(dá). 研究者們利用這一原理進(jìn)行合成遺傳電路設(shè)計,使用遠(yuǎn)程超聲激活Piezo1控制嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)轉(zhuǎn)錄表達(dá), 進(jìn)而識別根除靶腫瘤細(xì)胞. 該方法是模塊化的, 具有高時空精度、遠(yuǎn)程控制和非侵入性等優(yōu)勢, 用于優(yōu)化免疫治療[75].

4 結(jié)論

Piezo1介導(dǎo)力學(xué)信號調(diào)控腫瘤細(xì)胞惡性特征、血管新生、免疫微環(huán)境等相關(guān)研究目前尚處起步階段, 相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究仍具有較大局限性, 包括體外精準(zhǔn)模擬力學(xué)微環(huán)境困難, 尤其三維層面的精準(zhǔn)模擬; 此外, 用于力學(xué)信號研究的理想動物模型缺乏, 對干預(yù)反證實(shí)驗(yàn)的開展形成制約. Piezo1研究多聚焦其表達(dá)及活化對腫瘤細(xì)胞惡性特征的調(diào)控, 忽視腫瘤與胞外基質(zhì)或流體力學(xué)信號的相互作用. 另一方面, Piezo1研究也面臨一些新問題, 包括除鈣離子內(nèi)流通路外, Piezo1是否與其他機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在協(xié)同？貼壁和懸浮細(xì)胞Piezo1感應(yīng)和傳遞力學(xué)信號刺激的區(qū)別？Piezo1是否影響細(xì)胞骨架、核骨架進(jìn)而影響細(xì)胞形態(tài)表型？相信上述問題提出必將推動Piezo1介導(dǎo)力學(xué)信號調(diào)控腫瘤進(jìn)展機(jī)制的完整闡明.