陳巧玲 白亦光 別俊 楊蜜 張加勇

(南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院 1.腫瘤科;2.骨科， 四川 南充 637000)

骨是一種有活力的組織器官，在形成和溶解的動態(tài)狀態(tài)下保持平衡。其中成骨細胞是骨形成的重要細胞，參與維持機體的礦物質平衡[1]。當成骨細胞的分化過程受到阻礙，或者破骨細胞的活性亢進，都會導致骨質疏松癥等疾病[2]。骨質疏松癥是一種全身性的骨骼疾病，其特點是骨質微結構的退化，包括骨量減少和骨質脆性增加，這種變化增加了骨折的風險[3]。在骨質疏松的發(fā)生、發(fā)展過程中，成骨細胞的功能狀態(tài)具有重要作用[4]。另外，在腫瘤骨轉移等疾病發(fā)生發(fā)展過程中，由于腫瘤細胞的侵犯而導致成骨細胞的凋亡或分化功能的抑制，加重疾病的病程進展[5]。因此，研究成骨細胞的功能調控對于深入認識骨重建的過程及骨代謝疾病的防治具有重要價值。

磷脂酰肌醇3-激酶( PI3K)/ Akt 信號通路是正常生理狀態(tài)下細胞的基礎代謝通路，廣泛參與真核細胞的增殖、分化和能量代謝等過程[6]，并且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中還參與了腫瘤細胞的能量代謝[1]。本研究擬通過對PI3K蛋白的靶向抑制，探討在成骨細胞分化成熟的過程中，成骨細胞細胞外基質的分泌情況和PI3K/Akt 信號通路下游蛋白表達的變化，從而更深入地認識靶向PI3K/ Akt 信號通路在成骨細胞分化過程中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和實驗動物 胎牛血清( FBS，Gibco BR)； LY294002(美國 Sigma 公司)；0.25%胰蛋白酶(美國 Sigma 公司)； PBS工作液(碧云天，中國)；DMEM培養(yǎng)液(美國 Sigma 公司)；成骨細胞誘導培養(yǎng)基(OBM，美國Hyclone 公司)；4%多聚甲醛細胞固定溶液(碧云天，中國)；ALP染色試劑盒(碧云天，中國)；ALP活性分析試劑盒(碧云天，中國)；1%茜素紅染色液(pH4.2，bio-channel，中國)；GAPDH(D16H11)兔單克隆抗體(#5174)和PDK-1(D37A7)兔單克隆抗體、p-PDK1(C49H2)兔單克隆抗體和p-AKT(D25E6)兔單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology，Inc.)E.Z.N.A.總 RNA 提取試劑盒I(美國Hyclone 公司)；二抗抗兔辣根過氧化物酶結合IgG，1:1000；#58802(美國Cell Signaling Technology，Inc)。動物來源C57BL/6小鼠2只(4～6周齡，雌雄各1只)，購自川北醫(yī)學院動物中心。所有動物的實驗操作在川北醫(yī)學院倫理委員會監(jiān)督下進行。

1.2 骨髓間充質干細胞(BMSC)的培養(yǎng) 從無菌條件下分離小鼠股骨和脛骨，使用含有肝素的注射器沖洗骨髓腔，收集小鼠骨髓腔沖洗液，轉移到離心機100×g離心5 min，使用15%FBS的DMEM培養(yǎng)基重新懸浮的細胞，并轉移至T75細胞瓶中，放置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d更換培養(yǎng)基一次。待細胞融合率達70%～80%后進行傳代培養(yǎng)。

1.3 成骨細胞的誘導和實驗分組 收集第三代BMSC，以5×103個/cm2的密度接種于預先包被明膠的6孔培養(yǎng)板中，當細胞融合度達到60%～70%時，每孔加入2 mLOBM，然后在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。OBM需在37 ℃預熱，每隔3 d更換一次新鮮的OBM。誘導1周后，為避免成骨細胞脫落，每2 d將全培養(yǎng)基換成半培養(yǎng)基。對照組只使用OBM治療。LY294002組用在OBM中加入3 μM的LY294002進行處理。

1.4 CCK-8檢測BMSC的增殖以及LY294002的安全濃度 將BMSC接種于96孔板上，接種密度為1×104個/孔，添加三個副孔，在15%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。1 d后，用不同濃度的LY294002(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 μM)孵育48 h和96 h，每孔加入10 μL CCK-8緩沖液孵育2 h，用酶標儀在450 nm波長條件下讀取OD值。

1.5 堿性磷酸酶(ALP)染色和茜素紅染色 ALP染色：將待染細胞用PBS清洗5次，4%多聚甲醛細胞固定液固定30 min， PBS沖洗3～5次，配制并添加ALP染色工作液37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3～5次，倒置顯微鏡下觀察并采集圖片，并用ALP活性分析試劑盒檢測ALP的活性。

茜素紅染色：將待染細胞用PBS清洗5次,4%多聚甲醛細胞固定液固定30 min，PBS洗滌3～5次，用1%茜素紅染色工作液染色20 min。待肉眼可見工作液中出現(xiàn)紅色棉絮狀沉淀后，用PBS洗滌3～5次，顯微鏡觀察并采集圖像。體外礦化能力定量檢測：將細胞在10%的氯化十六烷基吡啶中連續(xù)攪拌，在室溫下過夜脫色。使用酶標儀562 nm波長下讀取OD值，標準化后獲得礦化定量值。

1.6 Western-Blot 使用RIPA蛋白裂解試劑盒說明書提取總蛋白。每孔加入1 mL蛋白裂解緩沖液，在4 ℃下裂解細胞30 min，4 ℃下收集裂解液，收集上清液，用比色法測定蛋白質濃度，用10%的 SDS-聚丙稀酰胺凝膠分離蛋白，濕式電轉移法將蛋白轉膜后，取出 PVDF 膜，用洗滌緩沖液在搖床上洗膜 10 min，在37 ℃的5%抗體封閉液中孵育1 h，并在4 ℃下與一抗孵育過夜：抗p-PDK1(稀釋度1∶1 000)，抗GAPDH(稀釋度1∶1 500)和抗p-AKT(稀釋度1∶1 000)。加入二抗(稀釋度1∶1 500)，將樣品在37 ℃孵育1 h，取出PVDF膜，在Odyssey機上掃膜，并分析灰度值。

1.7 Real-time PCR測定結果 根據(jù)E.Z.N.A.Total RNA Kit I試劑盒說明書提取并獲得細胞系的總RNA，使用QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix配制PCR反應液。使用的mRNA引物如下：骨鈣素(OCN)，5′-TCTGACAAAGCCTTCATGTCC-3′，5′-AAATAGTGATACCGTAGATGCG-3′。ALP，5′-GTGACTACCACTCGGGTGAAC-3′，5′-CTCTGGT GGCATCTCGTTATC-3′。GAPDH, 5′-GCATCTC CCTCACAATTTCCA-3′，5′-TGCAGCGAACTTTA TTGATGGT-3′。用標準樣品計算OCN和ALP基因表達，并與GAPDH基因表達進行歸一化。

2 結果

2.1 LY294002對BMSC的細胞活性影響 LY294002的分子結構式見圖1A。藥物濃度在6.4 μM時會對BMSC的細胞活性產(chǎn)生抑制作用(P<0.05)，見圖1B；藥物濃度在3.2 μM及以下時未見明顯的抑制細胞增殖活性作用。

圖1 LY294002的分子結構式和不同藥物濃度對BMSC的細胞活性的影響

2.2 LY294002對成骨細胞的分化呈劑量依賴性 OBM培養(yǎng)基中添加不同劑量的LY294002，對BMSC進行成骨細胞方向誘導，使用ALP染色法對成骨細胞的細胞外基質中ALP的表達進行鑒定。LY294002的濃度梯度設置為1、2、3 μM，結果顯示LY294002對成骨細胞的分化對產(chǎn)生不同程度的影響，呈現(xiàn)出劑量依賴性(P<0.05)，見圖2。

圖2 不同濃度的LY294002對成骨細胞分化的影響

2.3 LY294002 抑制成骨細胞ALP的表達和細胞礦化能力 添加濃度為3 μM的LY294002至OBM為干預組，觀察成骨細胞外基質ALP和礦化能力的變化，發(fā)現(xiàn)ALP陽性細胞的數(shù)量明顯減少(圖3A)。茜素紅染色提示，細胞外鈣結節(jié)的數(shù)量也明顯減少(圖3B)，同時對ALP活性和細胞外基質礦化定量檢測，發(fā)現(xiàn)結果同ALP和茜素紅染色結果一致(圖3C～D)。這提示LY294002 明顯抑制了成骨細胞外基質的形成。

圖3 LY294002對成骨細胞外基質的影響

2.4 LY294002下調了p-PDK1和p-Akt蛋白的表達 免疫印跡所示，LY294002存在的情況下，細胞中磷酸化的PDK-1 和Akt出現(xiàn)明顯的下調(均P<0.05)，表明LY294002通過調控PDK-1 /Akt信號通路對成骨細胞分化產(chǎn)生影響，見圖4。

圖4 成骨細胞p-PI3K和p-Akt蛋白的表達

2.5 LY294002下調了成骨細胞相關基因ALP和OCN mRNA的表達 使用real-time PCR對成骨細胞分化早期的ALP以及在成骨細胞分化晚期的OCN基因進行檢測，結果提示LY294002下調了成骨細胞相關基因ALP和OCN mRNA的表達(P<0.05)，見圖5A～B。

圖5 成骨細胞相關基因的表達

3 討論

PDK-1/AKT信號通路參與調節(jié)體內(nèi)正常細胞以及腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運，特別是凋亡和細胞存活[7]。PI3K作為PDK-1/AKT信號通路的上游調控蛋白，是幾條凋亡途徑中的關鍵控制點[8]。當PI3K被激活時，可以誘導第二信使PIP2和PIP3[9]。AKT是PI3K和PIP3的重要下游靶點，它可以與質膜上募集的PIP3相互作用，然后被PDK-1部分磷酸化并激活[10]，從而調節(jié)下游通路，促進細胞存活。目前針對該信號通路對成骨細胞的分化作用研究較少。本研究通過靶向抑制PI3K，觀察對體外誘導成骨細胞分化的影響，旨在了解靶向抑制PI3K對骨質破壞或骨質疏松治療的作用機制。

BMSC是體內(nèi)成骨細胞的主要來源[11]。在體外誘導BMSC向成骨細胞分化的過程可以模擬體內(nèi)形成成骨細胞成熟的過程[12]。在本實驗中，采用體外培養(yǎng)C57BL/6小鼠BMSC，通過CCK-8檢測獲得LY294002的安全濃度，在3.2 μM及以下濃度安全濃度范圍以下，發(fā)現(xiàn)在對BMSC的增殖活性并沒有產(chǎn)生影響。但在OBM中添加不同濃度的LY294002對BMSC進行誘導發(fā)現(xiàn)，成骨細胞的分化成熟產(chǎn)生了阻礙，這種影響呈現(xiàn)劑量依賴性。之后，對細胞進行分組，對照組使用OBM處理BMSC，干預組在OBM中添加LY294002，通過細胞形態(tài)學觀察并檢測細胞ALP活性和體外礦化能力，結果提示干預組ALP陽性細胞和細胞外基質礦化明顯減少(P<0.05)。采用Western -Blot和RT-PCR檢測PDK-1/Akt通路及下游轉錄因子基因和蛋白的表達水平。觀察兩組細胞在成骨分化過程中的變化。結果顯示干預組p-PDK-1和p-Akt蛋白表達水平較對照組明顯降低。干預組成骨細胞相關基因ALP和OCN mRNA較對照組明顯下降。

mTOR的特異性抑制劑雷帕霉素可以抑制成骨細胞分化[13]。Pan等[14]發(fā)現(xiàn)抑制PI3K激酶可阻斷胎鼠顱骨細胞的ALP活性。Bai等[15]發(fā)現(xiàn)特異性抑制PDK-I蛋白的表達可以阻礙成骨細胞的分化成熟。那些研究的結果與本研究結果相似。有學者[16]認為成骨細胞分化最初由BMSC收到一系列調控因素而產(chǎn)生細胞外基質，并表達成骨細胞生長所需要的調節(jié)因子。隨后細胞外基質分泌逐漸成熟，堿性磷酸酶表達增強和膠原蛋白沉積增加[17]。在最后礦化的階段，骨涎蛋白和OCN的表達和分泌增加，最終開始履行骨形成的生物活性[18]。本研究在誘導分化過程中也進一步證實了這一過程。OBM主要成分為抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松。該培養(yǎng)基能促進BMSC向成骨細胞分化，已被廣泛接受。這些成分被認為是BMSC礦化成熟的必要條件[19]。BMSC在這一過程中分化成熟并獲得了成骨細胞的形態(tài)和生長特性[20]。

4 結論與啟示

本研究結果顯示，通過對PI3K蛋白的抑制，PI3K/Akt信號通路中明顯下調了p-PDK-1和p-Akt蛋白表達水平，成骨細胞相關基因ALP和OCN mRNA表達也明顯下降。但PI3K/AKT信號通路中下游的蛋白是如何變化的尚不清楚。在后續(xù)研究中，將開展一些體內(nèi)研究，以期獲得治療骨質代謝疾病或腫瘤骨質破壞的新靶點。