楊瑜 劉耀河 秦寧 譚柳 宋銳 侯歌 袁金金 張艷 劉宗文

(1.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院放射治療科，河南 鄭州 450014；2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河南 鄭州 450014)

食管癌是目前臨床最為常見的惡性腫瘤之一，預(yù)后效果差，5年生存率通常低于20%[1]。腫瘤細(xì)胞多通過單克隆或多克隆進(jìn)行復(fù)制，有絲分裂是腫瘤細(xì)胞增殖所需要的關(guān)鍵步驟[2]。Ccnb1是細(xì)胞有絲分裂的調(diào)節(jié)因子[2]，在許多癌癥中都有較高水平的表達(dá)[3]。Ccnb1與腫瘤的侵襲能力有密切關(guān)聯(lián)[4]，即在核內(nèi)Ccnb1表達(dá)水平較高的細(xì)胞，其侵襲能力較強(qiáng)。目前有研究表明，在多種腫瘤疾病中，環(huán)狀RNA cir-ccnb1可以通過抑制ccnb1的功能影響腫瘤的發(fā)展，但在食管癌中報(bào)道鮮少。本研究通過免疫組化實(shí)驗(yàn)，檢測ccnb1在食管癌組織中的表達(dá)量，并通過增殖、劃痕實(shí)驗(yàn)，探討cir-ccnb1對 ccnb1的功能以及對食管癌細(xì)胞增殖、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 組織、細(xì)胞來源

1.1.1 組織來源 收集鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院2014～2015年收治的60例患者手術(shù)切除的食管鱗癌標(biāo)本以及癌旁正常食管粘膜組織標(biāo)本。入組條件：①術(shù)前有接受過放療或化療的，均排除。②術(shù)式不能選擇根治術(shù)的均排除。選取標(biāo)本：男性42例，女性18例；65歲以上(含65歲)32例，65歲以下28例。Ⅰ、Ⅱ期32例，Ⅲ、Ⅳ期28例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無轉(zhuǎn)移29例。

1.1.2 細(xì)胞系 正常食管上皮細(xì)胞(Het1-A)和食管鱗癌細(xì)胞(EC109)均由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院饋贈。

1.2 免疫組化與蛋白免疫印跡

1.2.1 免疫組化 新鮮標(biāo)本進(jìn)行多聚甲醛固定，過夜后石蠟包埋，切成3 μm厚度切片。石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水化，抗原修復(fù)后阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，封閉。37 ℃下濕盒中孵育，取出恢復(fù)至室溫。應(yīng)用生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG孵育。滴加辣根過氧化酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液。DAB進(jìn)行顯色，鏡下觀察染色分化、返藍(lán)后進(jìn)行脫水，中性樹脂封片，200倍鏡下觀察。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)細(xì)胞數(shù)500個(gè)進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：①不顯色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，褐色3分。②陽性細(xì)胞<5%為0分，5%為1分，10%為2分，50%為3分，75%為4分。將①與②相加后，<6分為低表達(dá)，≥6分為高表達(dá)。評分由兩名病理專家采取雙盲法進(jìn)行評價(jià)，若結(jié)論不一致則增加一名病理醫(yī)師進(jìn)行評價(jià)[5]。

1.2.2 蛋白免疫印跡 檢測食管癌細(xì)胞中ccnb1的表達(dá)，分別取對數(shù)生長期的Het1-A和EC109，將細(xì)胞分別種于6孔板，每孔2×105個(gè) /mL，當(dāng)生長達(dá)到90%左右時(shí)，應(yīng)用EDTA消化細(xì)胞，洗滌2次，裂解細(xì)胞后刮下細(xì)胞碎片，完成收集超聲裂解，離心提上清， BCA法測濃度，每孔25 μg加樣，恒壓90 V濃縮膠電泳再用120 V恒壓分離膠電泳。250 mA恒流轉(zhuǎn)膜，封閉非特異抗體，按抗體稀釋濃度1∶2000(ccnb1)，1∶2500(β-actin)。室溫下孵2抗2 h，ECL顯色液進(jìn)行顯色并暗示中曝光，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。應(yīng)用軟件Image J1.48進(jìn)行定量分析，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參條帶比值來評估蛋白表達(dá)水平。

1.3 過表達(dá)circ-ccnb1后對EC109生物學(xué)行為的影響

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 將EC109細(xì)胞分3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)： Blank組、Vector組及circ-ccnb1組，分別取對數(shù)生長期的EC109細(xì)胞種于6孔板，每組有3個(gè)復(fù)孔，每孔種植細(xì)胞為2×105個(gè) /mL。24 h后對Vector和circ-ccnb1組分別應(yīng)用lipofectmine3000轉(zhuǎn)染攜帶空載體和cir-ccnb1的質(zhì)粒，饑餓轉(zhuǎn)染6 h，然后換為完全培養(yǎng)基。

1.3.2 核漿分離 按核漿分離試劑盒說明書進(jìn)行核漿分離及核質(zhì)裂解、收集細(xì)胞核蛋白等相關(guān)步驟操作，對提取的核蛋白分別進(jìn)行定量以及煮樣，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳測量蛋白的表達(dá)量，來衡量ccnb1蛋白的核轉(zhuǎn)位的量。以增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)作為核內(nèi)蛋白內(nèi)參，抗體稀釋濃度1∶2000。

1.3.3 細(xì)胞增殖能力檢測 按照上述處理細(xì)胞方法將細(xì)胞分別種植于96孔板，每孔2×103個(gè)細(xì)胞，加入100 μL培養(yǎng)基培育72 h后，加入10 μL CCK8溶液于37 ℃溫度下避光孵育2 h，測算530 nm處吸光值(A)，應(yīng)用公式：細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組A/空白對照組A×100%，計(jì)算出細(xì)胞增殖率。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 細(xì)胞遷移率檢測 同樣按照上述處理細(xì)胞方法將細(xì)胞分別種植于6孔板，待細(xì)胞生長至以單層形式鋪滿孔底后，使用200 μL的槍頭進(jìn)行劃痕，磷酸緩沖鹽溶液清洗后，每孔滴加2 mL 2%的胎牛血清培養(yǎng)液，拍照0、24 h的細(xì)胞遷移狀況，用Image J1.48計(jì)算細(xì)胞遷移率，計(jì)算方法：首先計(jì)算劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕愈合寬度)/0 h劃痕寬度；然后計(jì)算遷移率=實(shí)驗(yàn)組愈合率/空白對照組愈合率。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測食管癌及癌旁正常粘膜組織中ccnb1的表達(dá) 對食管鱗癌組織和癌旁正常粘膜組織進(jìn)行免疫組化，見圖1。ccnb1蛋白的表達(dá)在食管鱗癌中高于正常粘膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

圖1 食管鱗癌組織和癌旁正常粘膜組織中ccnb1的表達(dá)情況(200 ×)

表1 ccnb1蛋白在食管鱗癌組織及癌旁正常粘膜組織中的表達(dá)情況

2.2 食管鱗癌中ccnb1表達(dá)與臨床病理的關(guān)系 對免疫組化的結(jié)果進(jìn)行臨床病理分析，ccnb1蛋白的高表達(dá)與患者的性別、年齡無相關(guān)性(P>0.05)，與食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期有關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 食管鱗癌中ccnb1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 Het1-A與EC109中ccnb1表達(dá)水平的比較 Het1-A組中ccnb1的表達(dá)水平(0.67±0.14)低于EC109組(1.01±0.06)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.912，P=0.017)，見圖2。

圖2 Het1-A與EC109中的ccnb1的表達(dá)水平

2.4 過表達(dá)circ-ccnb1后ccnb1在核內(nèi)水平的變化 與Blank組和Vector組相比， circ-ccnb1組細(xì)胞核的ccnb1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與Vector組相比， circ-ccnb1組細(xì)胞的增殖率、遷移率降低(均P<0.05)，見圖3、表3。

表3 Ccnb1核轉(zhuǎn)位水平、細(xì)胞增值率、細(xì)胞遷移率的比較

圖3 3組細(xì)胞的ccnb1核轉(zhuǎn)位水平

3 討論

環(huán)狀RNA是一大類單鏈RNA，屬于非編碼RNA，具有廣泛的表達(dá)模式[6-8]。已知許多環(huán)狀RNA在癌癥的發(fā)展中發(fā)揮作用[9]。Circ-RNA表達(dá)譜在哺乳動物間具有保守性[10]。通過對小鼠和人類細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)的全基因組分析，揭示了環(huán)狀RNA的進(jìn)化保守性，提示其在細(xì)胞生理學(xué)中的具體作用[11-12]，由于其穩(wěn)定性的提高，環(huán)狀RNA可能比線性RNA更有效[13]?？紤]到環(huán)狀RNA的豐富度和進(jìn)化保守性，其可能具有潛在的調(diào)節(jié)作用[14-15]。環(huán)狀RNA在細(xì)胞質(zhì)中高度表達(dá)，且含有多個(gè)microRNA(miRNA)結(jié)合位點(diǎn)，有可能具有抑制miRNA活性的功能[16]。Du等[17]發(fā)現(xiàn)，circ-RNA不僅與蛋白質(zhì)結(jié)合，還調(diào)控蛋白質(zhì)的核轉(zhuǎn)位，影響細(xì)胞增殖。cir-ccnb1是來源于ccnb1基因的外顯子4和外顯子5，cir-ccnb1在癌組織中的含量顯著低于正常組織[7]，這就有可能說明cir-ccnb1是抑制腫瘤發(fā)展的一個(gè)因素。

環(huán)狀RNA對腫瘤相關(guān)疾病有著廣泛的研究前景。有研究發(fā)現(xiàn)，某些circ-RNA可以通過與蛋白質(zhì)結(jié)合來掩蓋其結(jié)合位點(diǎn)，抑或作為競爭物阻斷蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能[18]。目前對circRNA的研究主要集中在其作為有效分子海綿的功能上[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA作為一種新的生物標(biāo)志物具有巨大的潛力，并為早期診斷提供了新的思路[20]。對于其中circ-ccnb1相關(guān)的研究來說，Yang等[21]研究表明，環(huán)狀RNA 可以通過參與蛋白質(zhì)翻譯過程進(jìn)而影響腫瘤發(fā)展。值得注意的是，它還與多種信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的因子具有相互作用，通過某幾個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與之結(jié)合[22]。降低ccnb1誘導(dǎo)的有絲分裂活動是一種新機(jī)制，是研究出新的干預(yù)癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵[22]。本研究中免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中ccnb1的高表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期關(guān)系密切。據(jù)李麗等[23]報(bào)道，ccnb1在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展過程中呈高表達(dá)，這與本研究結(jié)果一致。通過研究食管鱗癌細(xì)胞上circ-ccnb1對ccnb1可產(chǎn)生作用，發(fā)現(xiàn)它可以抑制該蛋白的核轉(zhuǎn)位，阻止其功能的發(fā)揮，這就抑制了腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，從而抑制了食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移。

Fang等[22]通過動物實(shí)驗(yàn)，探討了circ-ccnb1作為癌癥治療藥物的可能性，并且取得了良好的效果。這些研究是具有突破性意義的，為circ-ccnb1的研究提供了廣闊的臨床應(yīng)用的前景。針對ccnb1的生物作用，應(yīng)用circ-ccnb1很可能會成為治療癌癥的一種新藥物或新手段。同時(shí)由于circ-ccnb1對腫瘤的抑制作用，它的表達(dá)水平的高低也可能作為判斷患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。

4 結(jié)論

cir-ccnb1可以通過抑制ccnb1在食管鱗癌細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)位抑制食管鱗癌的發(fā)展，即抑制其增殖和遷移，但尚不能證明年齡、性別存在差異性。