陳貝貝，彭志蘭，章超樺,2，*，林海生,2，高加龍,2，鄭惠娜,2，曹文紅,2，秦小明,2

(1.廣東海洋大學 食品科技學院/國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)/廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室/廣東省海洋生物制品工程實驗室/水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江 524088；2.大連工業(yè)大學 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034)

牡蠣(Crassostreahongkongensis)，廣泛分布于中國廣東、廣西等南部海域，富含蛋白質(zhì)、糖原和?；撬岬榷喾N營養(yǎng)物質(zhì)，有“海中牛奶”之稱[1]。牡蠣具有獨特的保健功能和藥用價值，《神農(nóng)本草經(jīng)》和《海藥本草》等記載,牡蠣具有重鎮(zhèn)安神、去煩熱等功效[2]；另外，柴胡加龍骨牡蠣湯具有抗抑郁作用，且效果顯著。抑郁癥是多發(fā)于各個年齡層的常見神經(jīng)疾病。近年來，越來越多的研究表明，抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展與腦內(nèi)神經(jīng)炎癥和氧化損傷相關(guān)[3]。有研究證明，牡蠣肉水提液可以改善腦部氧化應(yīng)激和腦衰老，提高大腦海馬區(qū)大錐體細胞數(shù)，提高腦部超氧化物歧化酶含量，降低丙二醛含量[4]；此外，牡蠣提取物對體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞也具有保護作用[5]。已有研究表明，牡蠣酶解產(chǎn)物具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗疲勞、抗衰老[6-9]等活性，然而，目前關(guān)于牡蠣是否能夠改善抑郁的相關(guān)研究較少，因此，牡蠣酶解產(chǎn)物是否具有抗抑郁作用有待進一步探究。

斑馬魚作為新型模式生物，具有成本低、用藥量少等多種優(yōu)點[10]，可以高通量地進行活性物質(zhì)篩選；同時，斑馬魚與人類有高達70%以上基因同源性[11]，并且有類似的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)形態(tài)[12-14]，作為實驗動物用于神經(jīng)行為學和神經(jīng)內(nèi)分泌學研究具備很大的潛力[15-16]。目前，國外對斑馬魚在神經(jīng)方面的研究較為完善，國內(nèi)關(guān)于斑馬魚相關(guān)研究較少，并且主要集中在利用斑馬魚進行藥物毒性篩選，并未對其進行有效的開發(fā)利用。為了探究牡蠣酶解產(chǎn)物的抗抑郁作用及其潛在機理，本研究選用成年斑馬魚作為實驗動物，建立慢性不可預(yù)測溫和應(yīng)激誘導的斑馬魚抑郁樣模型，擬通過藥物暴露方式補充牡蠣酶解產(chǎn)物，采用新穎環(huán)境測試和光暗箱等行為學測試評價牡蠣酶解產(chǎn)物干預(yù)對斑馬魚抑郁行為的改善作用；計算斑馬魚體重指數(shù)，測定斑馬魚外周組織中糖皮質(zhì)激素水平以及大腦中炎癥因子(TNF-α、IL-1β)、抗炎因子IL-10和神經(jīng)營養(yǎng)因子等表達水平，進而研究牡蠣酶解產(chǎn)物潛在的抗抑郁機理，希望為牡蠣酶解產(chǎn)物抗抑郁活性物質(zhì)的開發(fā)以及活性成分的篩選提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3～5個月月齡成年野生型近交短尾斑馬魚(雄雌比例約為1∶1)，購自上海乙諾水族科技有限公司，并安置在小型魚飼養(yǎng)設(shè)施中，實驗室環(huán)境安靜。

1.2 材料與試劑

新鮮香港牡蠣，購于廣東省湛江市東風市場。香港牡蠣廣泛分布于中國廣東、廣西等南部海域，是南海重要經(jīng)濟貝類，因此，本實驗選用香港牡蠣作為實驗原料。

動物蛋白酶，廣西南寧龐博生物工程有限公司，酶活力為3×105U/g；氟西汀，常州四藥制藥有限公司；E112-01/02，BCA蛋白含量試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；斑馬魚腦神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)試劑盒、斑馬魚皮質(zhì)醇(CORT)ELISA 試劑盒、斑馬魚白細胞介素1β(IL-1β)ELISA 試劑盒、斑馬魚腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA 試劑盒、斑馬魚白細胞介素10(IL-10)ELISA 試劑盒，江蘇酶免實業(yè)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

Lynx 6000型高速冷凍離心機、Varioskan Flash型多功能酶標儀，Thermo Scientific 公司；R-1005型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FDU-1100型真空冷凍干燥機，日本東京理化器械株式會社；SHZ-B型水浴恒溫振蕩器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；手工勻漿器。

1.4 實驗方法

1.4.1牡蠣酶解物制備

牡蠣酶解物(oyster hydrolysates，OHs)，參照李婉等[17]的方法制備并稍加改進。將牡蠣肉與3倍體積的蒸餾水(g:L)進行勻漿，調(diào)節(jié)pH值至7.0，加酶量1 000 U/g，于53 ℃水浴恒溫振蕩器中酶解5 h，100 ℃沸水浴滅酶10 min，迅速冷卻至室溫后離心。在4 ℃下以8 000 r/min離心20 min，過濾去除雜質(zhì)，取上清液進行濃縮，經(jīng)冷凍干燥后得OHs。

1.4.2實驗動物分組及給藥方法

斑馬魚以每組15條魚飼養(yǎng)在6 L帶有過濾裝置和供氧裝置的小水箱里，水箱中水溫 (25±2)℃,pH值7.0～7.4，溶解氧量(8.5±1.2)mg/L，12 h循環(huán)光暗交替。斑馬魚每日投喂飼料2次(上午8點，下午6點)，每次投喂量1.5 g/kg，飼養(yǎng)至少14 d以適應(yīng)實驗室環(huán)境(飼養(yǎng)條件及飼料投喂量參考文獻[18-19])。斑馬魚給藥劑量參考文獻[20]中的急性毒性預(yù)實驗：將斑馬魚分別浸泡在100、200、400、800、1 600 mg/L牡蠣酶解液中，1 h后發(fā)現(xiàn)800、1 600 mg/L組斑馬魚頭部有紅斑，100、200、400 mg/L組斑馬魚頭部無紅斑，確定斑馬魚最大耐受劑量為600 mg/L；將最大耐受劑量作為高劑量組，并依次3倍遞減濃度確定中劑量組和高劑量組給藥濃度。斑馬魚具體分組及給藥劑量情況見表1。在整個實驗過程中，空白對照組不作任何應(yīng)激及藥物處理，用藥組在應(yīng)激的第4周開始給藥，每天上午8:30喂食后給藥，給藥完成后對其進行應(yīng)激處理。給藥方式為：將給藥組的斑馬魚分別撈出至相應(yīng)藥物濃度的1.5 L塑料容器中(容器中裝有0.5 L相應(yīng)濃度的藥物)，藥物暴露30 min，給藥方式參考文獻[21]。

表1 實驗動物分組及給藥劑量Tab.1 Grouping of experimental animals and dosages

1.4.3斑馬魚抑郁模型構(gòu)建與行為學實驗

1)實驗造模。選用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激斑馬魚抑郁模型。慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁動物模型目前應(yīng)用較為廣泛，該模型與抑郁癥發(fā)病過程具有高度的相似性。主要通過捕食者暴露、食物剝奪、黑暗處理、擁擠環(huán)境等應(yīng)激項目對斑馬魚造成不可預(yù)知的慢性應(yīng)激。應(yīng)激流程參考Song等[21]35 d斑馬魚慢性不可預(yù)知模型，并稍加改動，第25天的應(yīng)激項目更換為黑暗處理。

2)行為學實驗。參考Egan等[22]新穎環(huán)境實驗(NTT)和Cachat等[23]光暗箱實驗(LDB)，記錄斑馬魚在測試模型中的行為，進而分析斑馬魚抑郁樣行為是否得到改善。在實驗的第36天，上午9點至下午2點之間，對斑馬魚進行行為學測試。

NTT行為學測試:將預(yù)處理的斑馬魚隨著其生活水緩慢倒入梯形測試水槽中，用高清攝像頭記錄斑馬魚在水槽中上部停留時間(在水槽上部所有停留時間)，記錄時長為5 min。NTT行為學設(shè)備為一個1.5 L梯形水箱(高度15 cm×頂部長度28 cm×底部長度23 cm×寬度7 cm)，將梯形水箱最大程度裝滿水，并通過線條在設(shè)備外部標記為兩個相等的虛擬水平。

LDB行為學測試:將預(yù)處理的斑馬魚隨著其生活水緩慢從黑暗區(qū)倒入光暗箱中，用高清攝像頭記錄斑馬魚在光暗箱中的黑暗區(qū)潛伏期(從黑暗處第一次來到光亮處前持續(xù)時間)和在光亮處停留時間，記錄時長5 min。LDB行為學設(shè)備為一個12 L矩形水箱(高度20 cm×長度30 cm×寬度20 cm)，以中線為界限，一半采用無光線黑暗遮光處理。

行為學測試結(jié)束后，以冰浴的方式犧牲動物，并記錄每條斑馬魚體重及體長。在冰面快速解剖斑馬魚，解剖頭部取腦。將組織標本過液氮后迅速放于-80 ℃保存，避免反復凍融。

1.4.4外周組織中皮質(zhì)醇含量測定

取出魚身組織，按質(zhì)量(g)與體積(mL)比為1∶9的比例加入9倍體積的磷酸鹽緩沖液，pH值為7.4。用手工勻漿器將標本勻漿充分，離心20 min(3 000 r/min)，仔細收集上清液并分裝。測定魚身組織蛋白濃度，具體實驗操作參考BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行。參考斑馬魚皮質(zhì)醇ELISA試劑盒說明書，測定外周組織中皮質(zhì)醇含量。

1.4.5魚腦組織炎癥相關(guān)細胞因子含量測定

魚腦樣本處理方式同1.4.4。采用斑馬魚TNF-α、IL-1β和IL-10 ELISA試劑盒測定魚腦組織中TNF-α、IL-1β和IL-10的含量，具體操作參照說明書。

1.4.6魚腦組織腦神經(jīng)營養(yǎng)因子含量測定

魚腦樣本處理方式同1.4.4。采用斑馬魚神經(jīng)營養(yǎng)因子ELISA試劑盒測定魚腦中神經(jīng)營養(yǎng)因子的含量，具體操作參照說明書。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果均以平均值±標準差表示，所有數(shù)據(jù)采用JMP Pro13軟件進行統(tǒng)計學分析，采用Origin 2017和Excel等軟件制圖。對數(shù)據(jù)進行組間差異性顯著分析，采用最小二乘均值Studentt檢驗判斷組間差異。所有分析中，組間差異顯著以P<0.05表示，組間差異極顯著以P<0.01表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣酶解產(chǎn)物對斑馬魚抑郁樣行為的影響

慢性不可預(yù)測應(yīng)激的小鼠和大鼠抑郁樣模型是目前抑郁癥研究領(lǐng)域使用最廣泛的模型，近年來對斑馬魚也建立了相應(yīng)的慢性應(yīng)激抑郁樣模型[21,24-25]。目前對斑馬魚抑郁樣行為的測定主要采取NTT和LDB兩個行為學測定實驗。斑馬魚進入陌生的新環(huán)境，需要一個探索和適應(yīng)的過程。在NTT測試中，把斑馬魚放進新環(huán)境測試水槽中時，大部分斑馬魚會游到水槽底部或者角落，直到它們適應(yīng)周圍環(huán)境，才會開始試探性地慢慢擴大游動范圍向上部游動；在新環(huán)境中，斑馬魚在上部停留時間與魚的緊張焦慮程度呈負相關(guān)。在LDB測試中，把斑馬魚放進光暗箱中時，大部分斑馬魚會偏好光線比較弱的地方，直到它們適應(yīng)周圍環(huán)境，才會慢慢從黑暗區(qū)游出開始向光亮區(qū)游動。在新環(huán)境中，斑馬魚在光亮區(qū)停留時間與魚的緊張焦慮程度呈負相關(guān)，游出黑暗處所需的時間(也就是在黑暗區(qū)潛伏期)和魚的緊張焦慮程度呈正相關(guān)。在NTT和LDB行為學實驗中，每組選取12條斑馬魚，進行行為學觀察，得到實驗結(jié)果。

通過NTT行為學實驗得到圖1。由圖1可知，與空白組相比，應(yīng)激模型組(斑馬魚在上部停留時間極顯著減少，此現(xiàn)象與Egan等[22]新穎環(huán)境測試實驗結(jié)果相似，說明應(yīng)激組斑馬魚出現(xiàn)了明顯的焦慮行為；與應(yīng)激模型組相比，陽性對照組斑馬魚在上部停留時間極顯著增加，說明陽性藥物氟西汀對緩解斑馬魚焦慮行為有很好的效果；同時，與應(yīng)激模型組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組斑馬魚在上部停留時間均有不同程度的顯著增加，說明低、中、高濃度的牡蠣酶解物對斑馬魚焦慮行為有明顯改善。伴隨著牡蠣酶解物給藥劑量的增加，斑馬魚在上部停留時間先上升后下降，中劑量組斑馬魚在上部停留時間最長，其改善斑馬魚在NTT行為學實驗中焦慮行為效果最好。

#表示與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01)；*表示與應(yīng)激模型組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與應(yīng)激模型組相比差異極顯著(P<0.01)。圖1 牡蠣酶解物對NTT實驗中斑馬魚行為的影響Fig.1 Effect of oyster hydrolysates on zebrafish behavior in NTT experiment

通過LDB行為學實驗得到圖2。由圖2(a)可知：與空白組相比，應(yīng)激模型組斑馬魚在黑暗區(qū)潛伏期時間極顯著增加，由圖2(b)可知，應(yīng)激模型組在光亮區(qū)停留時間顯著減少，此現(xiàn)象與Cachat等[23]光暗箱測試實驗結(jié)果相似，說明模型組的斑馬魚行為焦慮程度明顯高于空白組；與應(yīng)激模型組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組斑馬魚在光亮區(qū)停留時間均有不同程度的顯著增加，在黑暗區(qū)潛伏期均有不同程度的減小，中劑量組在黑暗區(qū)潛伏期最短而且在光亮區(qū)停留時間最長，均表現(xiàn)出明顯的改善焦慮行為的作用，說明中劑量組改善斑馬魚在光暗箱中焦慮行為效果最佳。

#表示與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01)；*表示與應(yīng)激模型組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與應(yīng)激模型組相比差異極顯著(P<0.01)。圖2 牡蠣酶解物對LDB實驗中斑馬魚行為的影響Fig.2 Effect of oyster hydrolysates on zebrafish behavior in LDB experiment

由圖1和圖2可知，在一定藥物劑量范圍內(nèi)，隨著藥物濃度增高，斑馬魚抑郁行為改善效果越明顯，具有一定的劑量依賴性。中劑量組牡蠣酶解物在NTT和LDB行為學實驗中均對斑馬魚焦慮行為改善效果最好，反而過高的藥物劑量對斑馬魚焦慮行為并沒有更好的改善。這個現(xiàn)象可能是因為高濃度的牡蠣酶解物溶液本身腥味過大，而斑馬魚嗅覺十分敏感[26]，太腥的氣味容易對斑馬魚造成一定的應(yīng)激。Oliveira等[27]研究中發(fā)現(xiàn)，斑馬魚暴露于死亡物種的氣味中也會表現(xiàn)出防御狀態(tài)，且皮質(zhì)醇含量上升，而長期的高水平皮質(zhì)醇會進一步刺激下丘腦-垂體-腎上腺軸，致其功能失調(diào)，進而導致大腦海馬受到損傷。另一種可能是，濃縮食品提取物的暴露會改變水質(zhì)參數(shù)(如pH值或滲透壓)，從而進一步間接給斑馬魚帶來壓力。因此，牡蠣酶解物高劑量組可能不是最佳給藥劑量組，具體原因需要在后續(xù)實驗中進一步探究。

2.2 牡蠣酶解產(chǎn)物對斑馬魚體重指數(shù)的影響

經(jīng)歷慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激的動物體重會顯著下降[28]，體重和體重指數(shù)(BMI)都是反映機體胖瘦的評判標準，體重指數(shù)是目前最常用的一個評判標準，同時也是衡量魚類胖瘦程度的非常重要的指標[29]。Dreimüller等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在抗抑郁治療反應(yīng)過程中，伴隨患者抑郁程度的降低，患者BMI有升高的現(xiàn)象。本研究采用斑馬魚體重(g)與體長(cm2)的平方之比[30],來計算BMI。由斑馬魚BMI得圖3，由圖3可知：與空白組相比，應(yīng)激模型組斑馬魚體重指數(shù)極顯著下降；與應(yīng)激模型組相比，陽性對照組斑馬魚體重指數(shù)極顯著上升，說明陽性藥物對改善應(yīng)激后斑馬魚體重指數(shù)下降有很好的效果；與應(yīng)激模型組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組斑馬魚體重指數(shù)均有不同程度的顯著增加，說明低、中、高濃度的牡蠣酶解物對斑馬魚體重下降均有明顯的改善，中劑量組改善斑馬魚體重下降效果最好。

2.3 牡蠣酶解產(chǎn)物對斑馬魚外周組織皮質(zhì)醇含量的影響

#表示與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01)；*表示與應(yīng)激模型組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與應(yīng)激模型組相比差異極顯著(P<0.01)。圖3 牡蠣酶解物對斑馬魚體重指數(shù)的影響Fig.3 Effect of oyster hydrolysates on zebrafish body mass index

皮質(zhì)醇是一種糖皮質(zhì)激素。機體分泌過多的皮質(zhì)醇會導致神經(jīng)細胞被損壞，抑制正常的下丘腦-垂體-腎上腺軸負反饋機制；過高水平的皮質(zhì)醇進而過度刺激大腦海馬皮質(zhì)醇受體，使海馬正常功能受到損傷，并導致海馬5-羥色胺和去甲腎上腺素缺乏癥，影響行為認知功能，這些變化與抑郁癥患者腦部神經(jīng)中樞變化的觀察結(jié)果一致[31]。斑馬魚外周組織皮質(zhì)醇含量測定結(jié)果見圖4，由圖4可知：與空白組相比，應(yīng)激模型組斑馬魚魚身組織內(nèi)皮質(zhì)醇的含量顯著增加；與應(yīng)激模型組相比，陽性組、低劑量組、中劑量組和高劑量組使用藥物之后，顯著減少了慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激誘導的斑馬魚皮質(zhì)醇含量的增加。這種現(xiàn)象說明，牡蠣酶解物降低了斑馬魚的皮質(zhì)醇含量，有助于調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇對下丘腦-垂體-腎上腺軸的負反饋以及減少對海馬的損害，進而改善抑郁狀態(tài)。中劑量組降低斑馬魚皮質(zhì)醇在魚身中表達的效果最好。

2.4 牡蠣酶解產(chǎn)物對斑馬魚腦部炎癥相關(guān)細胞因子的影響

#表示與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01)；*表示與應(yīng)激模型組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與應(yīng)激模型組相比差異極顯著(P<0.01)。圖4 牡蠣酶解物對斑馬魚外周皮質(zhì)醇含量的影響Fig.4 Effect of oyster hydrolysates on peripheral cortisol content of zebrafish

細胞因子是免疫細胞分泌的生物活性蛋白，它們是細胞之間的信息傳遞者，有協(xié)調(diào)免疫反應(yīng),參與神經(jīng)化學和調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌的作用。膠質(zhì)細胞可被視為腦內(nèi)特化的免疫細胞，主要由小膠質(zhì)細胞(BV2)產(chǎn)生。當BV2受到應(yīng)激時，被激活的BV2可表現(xiàn)為兩種狀態(tài)，M1型BV2主要分泌致炎因子，M2型BV2分泌抗炎因子及神經(jīng)營養(yǎng)因子。

TNF-α和IL-1β是炎癥細胞因子的重要成員，他們的表達水平與抑郁程度呈正相關(guān)。TNF-α和IL-1β可激活NF-κB和JNK等信號通路，進而促進炎癥因子的表達和細胞凋亡，同時它們能促進下丘腦釋放促腎上腺皮質(zhì)激素，最終導致腎上腺皮質(zhì)分泌更多的糖皮質(zhì)激素，破壞下丘腦-垂體-腎上腺軸的正常調(diào)節(jié)機制，并進一步導致糖皮質(zhì)激素水平上升、海馬受損，這些現(xiàn)象與抑郁癥的發(fā)病有關(guān)。斑馬魚腦組織TNF-α和IL-1β的含量測定結(jié)果見表2。由表2可知：與空白組相比，應(yīng)激模型組經(jīng)應(yīng)激后，斑馬魚腦內(nèi)TNF-α的含量極顯著增加，IL-1β的含量顯著增加；與應(yīng)激模型組相比，使用低劑量組、中劑量組和高劑量組牡蠣酶解物之后，顯著減少了慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激誘導的斑馬魚腦部TNF-α含量的增加，中劑量組降低斑馬魚TNF-α腦內(nèi)含量效果最為顯著；給藥后斑馬魚腦部IL-1β含量也不同程度的降低，由表2知，中劑量組降低IL-1β腦內(nèi)含量效果最好，但無顯著性差異。本研究表明，低、中、高濃度的牡蠣酶解物能通過改變斑馬魚腦部的組織炎癥因子含量來改善斑馬魚抑郁樣行為，其中中劑量組降低斑馬魚腦部炎癥因子含量效果最好，尤其是對TNF-α含量的降低起了很重要的作用。

表2 牡蠣酶解物對斑馬魚腦部致炎因子含量的影響Tab.2 Effect of oyster hydrolysates on contents of inflammatory factors in brain of zebrafish pg/mg

IL-10作為一種重要的抗炎和免疫調(diào)節(jié)細胞因子，能夠通過激活JAK1/STAT3信號通路下調(diào)Bax表達、上調(diào)Bcl-2表達，抑制神經(jīng)元細胞凋亡，從而發(fā)揮強大的神經(jīng)保護作用。IL-10還能抑制小膠質(zhì)細胞生成促炎癥因子,從而降低星形膠質(zhì)細胞的反應(yīng)性,促進星形膠質(zhì)細胞分泌TGF-β,減弱了小膠質(zhì)細胞的活化[32]。斑馬魚腦組織IL-10的含量測定結(jié)果見圖5。由圖5可知：與空白組相比，應(yīng)激模型組經(jīng)應(yīng)激后，腦內(nèi)IL-10水平極顯著高于空白組；酶解物低劑量組和中劑量組腦內(nèi)IL-10 含量高于應(yīng)激組，但無顯著差異，這可能是由于成年斑馬魚有很強的神經(jīng)修復能力。Zhang等[33]對損傷誘導的成年斑馬魚腦再生進行長期體內(nèi)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)斑馬魚大腦組織在損傷后的第43天完全恢復，這說明斑馬魚在接收到應(yīng)激帶來的損傷時，能迅速進行自我修復，這一現(xiàn)象與Song等[21]實驗中得到的應(yīng)激后腦內(nèi)IL-10含量較空白組升高的研究結(jié)果相似。

#表示與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01)。圖5 牡蠣酶解物對斑馬魚腦部抗炎因子IL-10含量影響Fig.5 Effect of oyster hydrolysates on contents of anti-inflammatory factors IL-10 in brain of zebrafish

2.5 牡蠣酶解物對斑馬魚腦部神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響

#表示與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)，##表示與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01)。圖6 牡蠣酶解物對斑馬魚腦部神經(jīng)營養(yǎng)因子含量的影響Fig.6 Effect of oyster hydrolysates on BDNF content in zebrafish brain

神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類對神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持的蛋白質(zhì)，可促進神經(jīng)元的生長和分化，影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成和神經(jīng)元的可塑性。斑馬魚腦部神經(jīng)營養(yǎng)因子含量測定結(jié)果見圖6。由圖6可知：與空白組相比，應(yīng)激模型組經(jīng)過應(yīng)激后，斑馬魚腦部神經(jīng)營養(yǎng)因子含量顯著升高(P<0.05)，這與斑馬魚較強的神經(jīng)自我修復能力有關(guān)，這一現(xiàn)象與Song等[21]發(fā)現(xiàn)的斑馬魚應(yīng)激后腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子含量較空白組升高的研究結(jié)果相似；與應(yīng)激模型組相比，中劑量組增加了斑馬魚腦部神經(jīng)營養(yǎng)因子含量，但無顯著性差異；與陽性組相比，使用低劑量組、中劑量組牡蠣酶解物之后，均不同程度地增加了斑馬魚腦部神經(jīng)營養(yǎng)因子含量，其增加效果不顯著。

3 結(jié) 論

經(jīng)過慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激之后，斑馬魚在行為學測試中的表現(xiàn)為探索行為降低，趨暗行為增強，焦慮程度增加；斑馬魚體重指數(shù)降低；斑馬魚組織中的炎癥因子和皮質(zhì)醇水平升高。

經(jīng)過牡蠣酶解產(chǎn)物的給藥后，與應(yīng)激模型組相比，低、中、高劑量組牡蠣酶解產(chǎn)物給藥組的斑馬魚探索能力增強，表現(xiàn)為在上部停留時間升高；趨暗行為減弱，表現(xiàn)為在黑暗區(qū)潛伏期明顯縮短，在光亮區(qū)停留時間明顯升高，說明斑馬魚抑郁樣行為得到改善；斑馬魚體重指數(shù)明顯升高，外周組織皮質(zhì)醇水平明顯降低，且腦組織中的炎癥因子如TNF-α水平也明顯降低，說明牡蠣酶解產(chǎn)物可以降低斑馬魚組織中的TNF-α和皮質(zhì)醇的水平，抑制炎癥反應(yīng)，從而達到改善抑郁的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣酶解產(chǎn)物可以通過調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇水平以及抑制慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激誘導的炎癥反應(yīng)來改善斑馬魚的抑郁樣行為；中劑量組對斑馬魚抑郁樣行為改善效果較好，可以顯著改善斑馬魚抑郁樣行為，降低斑馬魚外周皮質(zhì)醇含量，降低腦部促炎細胞因子TNF-α的表達。