林佳麗，劉楊潔，韓富亮

(1.西北農林科技大學 葡萄酒學院/陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學 合陽葡萄試驗示范站，陜西 合陽 715300)

Caco-2細胞來源于人結腸腺癌細胞，在體外培養(yǎng)可形成致密單細胞層，其結構和功能與人體小腸上皮細胞組織相似，具有微絨毛結構，可分化多種人體腸細胞具有的酶和轉運蛋白，如葡萄糖苷酶、外排蛋白BCRP、P-gp、MRP2等[1]。多年來，Caco-2細胞已被廣泛應用于藥物或食品營養(yǎng)成分在腸道的消化吸收、轉運代謝及其機制的研究[2]，包括化合物消化水解、化合物的生物利用率及其結構與轉運吸收的關系、化合物轉運吸收的相互作用、化合物在上皮細胞的甲基化、葡萄糖醛酸化和磺酸化[3]等代謝轉化、化合物的主動吸收和被動吸收等。此外，也可用于研究化合物對腸道健康的作用，包括對腸道細胞屏障功能、細胞炎癥的影響等[4]。

糖苷類化合物，如花色苷、白藜蘆醇糖苷、柚皮苷等，由糖苷配體與葡萄糖或其他單糖組成，是廣泛存在于水果、蔬菜或食品中的化合物。這些化合物的吸收可能涉及主動吸收，即通過轉運載體進行轉運吸收。小腸上皮細胞可表達己糖轉運蛋白[5]，包括鈉依賴性葡萄糖轉運蛋白1(sodium glucose co-transporter 1，SGLT1)和葡萄糖轉運蛋白2(glucose transporter 2，GLUT2)。他們將葡萄糖從腸腔側吸收轉運進入細胞[6]。糖苷類化合物由于含有1個或2個以上的單糖，其吸收可能與己糖轉運載體有關。

Caco-2細胞單層的功能特性與細胞的來源、培養(yǎng)代數、培養(yǎng)條件等因素密切相關。培養(yǎng)基、細胞接種密度、培養(yǎng)時間等影響細胞的生長和分化[7]，包括細胞形態(tài)、緊密連接、蛋白表達等[8]。通常，研究化合物在Caco-2細胞單層的吸收轉運需要培養(yǎng)21天左右，以使細胞單層分化成熟并形成致密單層[1]。但是，在采用Caco-2細胞模型研究食品組分化合物的吸收轉運時，很少有研究對細胞模型進行比較全面的考察，特別是糖苷類化合物的吸收轉運。本研究通過對Caco-2細胞最適培養(yǎng)基的選擇、單層致密性的測定、單層通透性的測定、單層亞顯微結構的觀察、細胞兩側堿性磷酸酶活性比、細胞葡萄糖轉運蛋白SGLT1和GLUT2的mRNA及蛋白表達水平的分析，考察Caco-2細胞形態(tài)和功能完整性，為糖苷類化合物在腸道的轉運吸收及機制等研究提供方法學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Caco-2人結直腸腺癌細胞，上海富衡生物公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM低糖培養(yǎng)基，美國Gibco公司；胎牛血清，美國Gemini公司；GlutaMAX-I 添加劑、Hank’s平衡鹽溶液、Penicillin-Streptomycin溶液(PS)，北京Solarbio公司；苯酚紅，分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；質量分數為0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液、非必需氨基酸(L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸)，Thermo Fisher公司；堿性磷酸酶試劑盒，南京建成生物工程研究所；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)(pH 值7.2～7.4)，BI生物公司；質量分數1%的鋨酸，美國Tedpella公司；醋酸鈾，美國SPI公司；檸檬酸鉛，阿法埃莎(中國)化學有限公司；白膠，美國EMS公司；PVDF膜(0.45 μm)，美國Millipore公司；兔源SGLT1、GLUT2和內參GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)一抗，北京Bioss公司；山羊抗兔二抗，江蘇康為世紀公司；Transwell細胞小室(12孔，0.4 μm，1.12 cm2)，美國Corning公司。

由西安昊興生物科技有限公司設計引物序列，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成引物：

SGLT1：正向5′-CAGATGATGCGGGAGAAGAA-3′，反向5′-CGAAGATGCTCGTGGAGTAATA-3′；GLUT2：正向5′-ATGAACTGCCCACAATCTCATA-3′，反向5′-GGACCAGAGCATGGTGATTAG-3′；GAPDH：正向5′-CCTTCCTGGGCATGGAGTC-3′，反向5′-TGATCTTCATTGTGCTGGGTG-3′。

1.2 儀器與設備

311型二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo Fisher公司；IBE1000型倒置顯微鏡，重慶中顯光電儀器有限公司；Millicell ERS-2型電阻儀，美國Millipore公司；Cary 60型紫外可見分光光度計，美國Agilent公司；LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津公司；Nano SEM-450型場發(fā)射掃描電子顯微鏡、TECNAI G2 SPIRIT BIO T12型透射電子顯微鏡，美國FEI公司；CFX96型實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)儀、170-4481型電泳儀、Tanon4200型成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1Caco-2細胞培養(yǎng)與接種

參照Han等[5]方法，在37 ℃培養(yǎng)箱中，保持體積分數為5%的CO2及90%濕度培養(yǎng)細胞。以6×104個/cm2每孔0.5 mL接種細胞至12孔Transwell培養(yǎng)板上室，培養(yǎng)板下室添加1.5 mL培養(yǎng)基。

1.3.2Caco-2細胞最適培養(yǎng)基的選擇

選擇生長狀態(tài)良好的同代Caco-2細胞接板培養(yǎng)，使用血球計數板記錄細胞數量，分別比較體積分數為10%、15%、20%血清的DMEM低糖培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基對細胞生長的影響。

1.3.3Caco-2細胞吸收模型的評估

1.3.3.1 Caco-2細胞單層致密性測定

細胞單層跨膜電阻(transepithelial electrical resistance，TEER)值可以作為Caco-2細胞單層致密性的評估參數。TEER采用電阻儀測定，TEER計算見式(1)。

TEER=(TEER測定孔-TEER空白孔)×S0。

(1)

式(1)中，TEER值，Ω·cm2；S0為Transwell小室單孔膜面積(1.12 cm2)。

1.3.3.2 Caco-2細胞單層通透性測定

苯酚紅的透過性可以作為Caco-2細胞單層通透性的評估參數。Caco-2細胞培養(yǎng)至14、17、21 d時，Transwell上室添加苯酚紅的Hank’s平衡鹽溶液(苯酚紅的質量濃度為10 mg·L-1)0.5 mL，下室添加無苯酚紅的Hank’s平衡鹽溶液1.5 mL，孵育4 h。于0.5、1.0、2.0、4.0 h從下室中取樣0.15 mL。采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測苯酚紅含量。根據式(2)計算苯酚紅的表觀滲透系數(apparent permeability coefficient，Papp)。

(2)

式(2)中，Papp，cm·s-1；dQ/dt為單位時間苯酚紅轉運量，mg·L-1·s-1；C0為其初始濃度，mg·L-1；S0為Transwell小室單孔膜面積(1.12 cm2)。

1.3.3.3 場發(fā)射掃描電子顯微鏡分析

Caco-2細胞培養(yǎng)至7、14、17、21 d時，固定細胞單層，使用不同濃度的乙醇將樣品梯度脫水，臨界干燥，粘臺噴金，觀察細胞表面微絨毛。

1.3.3.4 透射電子顯微鏡分析

隨機取培養(yǎng)至14、17、21 d生長良好的Transwell小室固定細胞單層4 h以上，再用質量分數為1%的鋨酸固定樣品2 h。PBS漂洗，乙醇梯度脫水，白膠梯度滲透，包埋固化切片后，先后使用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，觀察細胞形態(tài)。

1.3.3.5 Caco-2細胞的堿性磷酸酶活性測定

細胞單層堿性磷酸酶活性(alkaline phosphatase，AKP)兩側比值[(apical side)/(basolateral side)，AP/BL]中可判斷細胞的分化水平。細胞培養(yǎng)至7、14、17、21 d時，采用分光光度計儀檢測OD值，計算細胞單層兩側堿性磷酸酶活性，公式見式(3)。

(3)

式(3)中，AKP活力單位是金氏單位/100 mL；OD測定值和OD標準值均為在520 nm處測定的吸光度值。

1.3.3.6 qPCR測定葡萄糖轉運蛋白SGLT1和GLUT2的mRNA表達

參考Huang等[9]方法并稍做修改，提取細胞中的RNA，檢測濃度與純度，調整至終濃度200 mg·L-1。反轉錄后，采用兩步法程序對反轉錄產物進行PCR擴增，用2-ΔΔCT法分析檢測結果。以內參基因GAPDH為對照。

1.3.3.7 蛋白質印跡法測定葡萄糖轉運蛋白SGLT1和GLUT2表達

蛋白質印跡法(Western blot)的測定參考Wong等[10]方法并稍做修改。細胞裂解后采用BCA法測定蛋白濃度，與蛋白上樣緩沖液混合后進行SDS-PAGE電泳。凝膠中的蛋白質濕轉到PVDF膜，分別與兔源SGLT1、GLUT2和GAPDH一抗孵育、再與HRP標記的山羊抗兔二抗孵育，雜交完成后使用HRP-ECL發(fā)光法對其鑒定，化學發(fā)光成像儀分析。以內參蛋白GAPDH為對照。

1.4 數據處理

采用Duncan法對實驗數據進行方差分析(P<0.05)(軟件SPSS 21.0)，軟件Origin繪制各類直方圖與折線圖。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基對Caco- 2細胞的影響

考察兩種培養(yǎng)基(DMEM低糖培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基)和3種血清體積分數(10%、15%、20%)對細胞生長的影響，結果見圖1。由圖1可知，在3種血清體積分數下，使用DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞從剛接板至鋪滿孔的細胞量均高于RPMI1640培養(yǎng)基。在同一血清體積分數下培養(yǎng)細胞時，DMEM低糖培養(yǎng)基的增速顯著高于RPMI1640培養(yǎng)基，其中圖1(b)顯示使用體積分數15%血清的兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞的快速增殖點出現顯著差異，而其余體積分數下的兩種培養(yǎng)基中，細胞的生長趨勢無顯著差異。Caco-2細胞在DMEM低糖培養(yǎng)基中生長速度更快，與DMEM低糖培養(yǎng)基所含營養(yǎng)物質比較適合貼壁細胞的生長有關[5]。

圖1 相同血清濃度不同培養(yǎng)基細胞生長情況Fig.1 Growth condition of cells in different media with same serum concentration

同種培養(yǎng)基下不同血清濃度對細胞影響的結果見圖2。由圖2可知，細胞前3 d在RPMI1640培養(yǎng)基生長比較穩(wěn)定，從第4天開始進入快速增殖期，而使用DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞時，15%和20%體積分數血清的培養(yǎng)基從第3天開始進入快速增殖，10%的則從第4天開始生長迅速。比較兩種培養(yǎng)基在不同體積分數血清下細胞的增殖速度可以看出，體積分數15%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞生長最快，20%的次之，10%的最慢。血清中含有多種因子促進細胞貼附，但是血清濃度過高不利于細胞生長[11]。因此，本研究選擇Caco-2的最適培養(yǎng)基為添加體積分數為15%血清的DMEM低糖培養(yǎng)基。

圖2 不同血清濃度下細胞生長情況Fig.2 Growth condition of cells in media with different serum concentration

2.2 Caco- 2細胞單層致密性評估

TEER測量是使用兩個電極連接腸腔側與基底外側，施加恒定的直流電，應用歐姆定律測量跨膜電阻[12]。對培養(yǎng)21 d的Caco-2細胞單層跨膜電阻值進行測定，見圖3。顯微鏡觀察，細胞在接種后10 d左右鋪滿小室，TEER約為250 Ω·cm2，隨后細胞開始迅速增殖，TEER相應增大，從第14天開始趨于穩(wěn)定，數值在1 300～1 500 Ω·cm2之間，表明連續(xù)培養(yǎng)14 d以上的細胞單層具有良好的致密性。文獻報道，Caco-2細胞單層的TEER約為200～1 000 Ω·cm2[13]，細胞單層TEER會在后期傳代中升高[7,14]。TEER是細胞間離子流動產生，受細胞自身形態(tài)及膜面積影響較大。單層膜出現缺口、破裂，電阻值會突降。因此，僅將TEER作為細胞致密性的參考。

2.3 Caco- 2細胞單層通透性分析

苯酚紅在Caco-2單層的表觀滲透系數可以表征細胞單層的通透性[7]。不同時期Caco-2細胞單層中苯酚紅的表觀滲透系數見表1，與空白組相比，14、17、21 d細胞的表觀滲透系數均小于1×10-6cm·s-1(表1)，并且各組間無顯著差異，這與其他研究采用熒光黃評價細胞單層通透性一致(0.26×10-6～0.69×10-6cm·s-1)[15]。圖4為轉運時間對Caco-2細胞單層苯酚紅的轉運透過量和轉運率的影響。14、17、21 d的細胞對苯酚紅的透過量基本穩(wěn)定，分別為0.79%、0.83%、0.84%[圖4(a)]，轉運率均不超過1%[圖4(b)]，與空白孔的3.88%呈現顯著差異(P<0.05)。有研究報道對14～16 d的Caco-2細胞模型進行通透性實驗，結果與此類似[16-17]。因此，培養(yǎng)14 d以上的Caco-2細胞單層已具有良好的致密性。

表1 不同時期Caco-2細胞單層中苯酚紅的表觀滲透系數Tab.1 Apparent permeability coefficient of phenol red in Caco-2 cell monolayer at different periods

圖4 轉運時間對Caco-2細胞單層苯酚紅透過量和轉運率的影響Fig.4 Effect of transport time on permeability and transport rate of phenol red in Caco-2 cell monolayer

2.4 Caco- 2細胞單層亞顯微結構觀察結果

2.4.1場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察結果

使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察Caco-2細胞表面絨毛，掃描電鏡圖見圖5。圖5顯示了具有腸細胞特征的分化Caco-2細胞，可以發(fā)現，細胞在培養(yǎng)第7 d時已經分化出稀疏的微絨毛，隨著培養(yǎng)時間延長，絨毛增長且密度增加。放大至6萬倍顯示，微絨毛的長度在300～900 nm，7 d的密度約為2～20根/μm2[圖5(e)]，14 d的密度約為60～180根/μm2，17 d的密度約為80～200根/μm2[圖5(f)]，圖5(f)方框內為2根完整的微絨毛。微絨毛上含有多種蛋白，微絨毛密度增大可以增加腸細胞的吸收面積，從而影響營養(yǎng)成分的吸收[18-19]。圖5表明培養(yǎng)的Caco-2細胞在第17 d時已大量分化微絨毛且分布均勻，與文獻報道培養(yǎng)21 d的細胞形態(tài)一致[20]。因此，從形態(tài)學上來看，培養(yǎng)14～17 d的Caco-2細胞適于用來研究營養(yǎng)物質的吸收轉運。

圖5 Caco-2細胞表面絨毛掃描電鏡Fig.5 Scanning electron microscopy of microvilli on Caco-2 cell surface

2.4.2透射電子顯微鏡觀察結果

使用透射電子顯微鏡觀察Caco-2細胞縱切面，透射電鏡圖見圖6。采用消化收集細胞進行切片不利于觀察細胞表面結構[21]，本研究采用細胞原位固定方式，直接將細胞連同Transwell膜切割制片，以在電鏡下觀察細胞培養(yǎng)過程中的形態(tài)，見圖6。透射電鏡觀察不同時期Caco-2細胞的縱切結構，箭頭所指為細胞分化的微絨毛，圖6(d)方框內為完整的3根微絨毛。由圖6可知，連續(xù)培養(yǎng)14 d后，Caco-2細胞腸腔側分化出微絨毛，而基底側無分化，表明培養(yǎng)過程中細胞兩側逐漸極化，并且可以看到Caco-2細胞融合成連續(xù)完整的細胞單層，細胞表面有連續(xù)的微絨毛，細胞間隙消失[圖6(b)]，微絨毛長度增加[圖6(d)]。有研究表明：微絨毛分化的長度及密度都會影響細胞蛋白表達[19]。因此，培養(yǎng)14～17 d的Caco-2適宜于作為細胞模型用來研究營養(yǎng)物質的吸收，這和掃描電鏡的觀察結果一致，比文獻報道的21 d提早4～7 d[16]。

圖6 Caco-2細胞單層透射電鏡Fig.6 Transmission electron microscopy of Caco-2 cell monolayer

2.5 Caco- 2細胞的堿性磷酸酶活性

堿性磷酸酶位于微絨毛上，基底側無分化。在培養(yǎng)過程中，細胞腸腔側逐漸分化出小腸吸收和消化的標志物-堿性磷酸酶，兩側堿性磷酸酶活性比值逐步升高，分布不對稱，出現了極化現象[22]。不同培養(yǎng)時間Caco-2細胞單層兩側(AP/BL)堿性磷酸酶活性比見表2。Caco-2細胞兩側堿性磷酸酶活性比分析表明，培養(yǎng)7 d的細胞堿性磷酸酶活性比僅為1.33，未達到極性分化。文獻表明：細胞在生長到完全鋪滿瓶壁時才開始單層分化[23]。在培養(yǎng)14 d時，細胞開始出現極性分化，但是顯著小于17 d和21 d的比值，而17 d與21 d的活性比無顯著差異(P<0.05)。這與文獻報道培養(yǎng)15～21 d細胞兩側堿性磷酸酶活性變化趨于平穩(wěn)相一致[22]，因此，培養(yǎng)14～17 d的Caco-2細胞可以用來做吸收轉運研究。

表2 Caco-2細胞單層兩側堿性磷酸酶活性比Tab.2 Activity ratio of alkaline phosphatase on both sides of Caco-2 cell monolayer

2.6 葡萄糖轉運蛋白SGLT1和GLUT2的mRNA及蛋白表達水平分析

食物中含有很多糖苷類化合物，如花色苷，葡萄糖苷類化合物的主動吸收需要葡萄糖轉運蛋白SGLT1和GLUT2的參與[3,5-6]。葡萄糖轉運蛋白SGLT1和GLUT2的mRNA的相對表達量見圖7。由圖7可知：連續(xù)培養(yǎng)14 d及以上的細胞均能表達兩種葡萄糖轉運載體的mRNA，其中SGLT1在14 d的表達量較高，隨著培養(yǎng)時間的延長，表達量顯著降低，但是17 d和21 d之間無顯著差異(P<0.05)，而GLUT2在細胞中的表達量隨著培養(yǎng)天數的增加會有少量升高，但差異不顯著(P<0.05)。不同培養(yǎng)時間的Caco-2細胞轉運蛋白表達水平見圖8。由圖8可知，以內參蛋白GAPDH為對照，葡萄糖轉運載體蛋白SGLT1和GLUT2的相對表達量分析結果表明：隨著培養(yǎng)時間的增加，SGLT1和GLUT2均能特異性表達，且相對表達量在14、17、21 d之間無顯著差異(P<0.05)。兩種糖轉運載體的mRNA和蛋白質相對表達水平的差異可能是翻譯和蛋白質降解等造成的[24]。通常，Caco-2細胞培養(yǎng)都是21 d，僅考察細胞單層的完整性或致密性來建立細胞模型，很少考察己糖轉運載體的表達和微絨毛形態(tài)分化等指標[2,22]。本研究基于轉運載體mRNA和蛋白表達量，證實Caco-2細胞培養(yǎng)14 d后即可用于葡萄糖苷類化合物的吸收轉運研究。

同組不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7 Caco-2細胞中SGLT1和GLUT2葡萄糖轉運蛋白mRNA表達水平Fig.7 mRNA expression of SGLT1 and GLUT2 glucose transporter in Caco-2 cells

同組相同字母表示差異不顯著(P<0.05)。圖8 不同培養(yǎng)時間的Caco-2細胞轉運蛋白表達水平Fig.8 Expression level of transporters in Caco-2 cells cultured for different days

3 結 論

細胞生長曲線結果表明，使用體積分數為15%血清的DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞效果最佳。在Transwell小室中連續(xù)培養(yǎng)14 d及以上的Caco-2細胞單層跨膜電阻值穩(wěn)定，細胞旁路轉運藥物苯酚紅表觀滲透系數小于1×10-6cm·s-1，細胞單層具有明顯極性，無細胞間隙，細胞表面連續(xù)、均勻分布微絨毛，己糖轉運蛋白SGLT1和GLUT2 mRNA及其蛋白特異表達。因此，研究建立的14～17 d的Caco-2可用于葡萄糖和葡萄糖苷類化合物的轉運吸收研究，與21 d相比提早4～7 d時間，縮短了培養(yǎng)周期，可保證細胞模型可靠性。