何偉，王莉，黃景鳳，劉磊，楊如鋼，黃升

1. 阿勒泰戈寶茶股份有限公司（阿勒泰 836500）；2. 阿勒泰戈寶茶股份有限公司烏魯木齊分公司（烏魯木齊 830015）；3. 阿勒泰戈寶茶股份有限公司深圳分公司（深圳 518001）

羅布麻Apocynum venetumL.（紅麻）是夾竹桃科羅布麻屬多年生宿根草本植物，唐代《新修本草》、明代《救荒本草》稱“漆澤”，近代《中國高等植物》稱“茶葉花”。自20世紀(jì)50年代起，先后經(jīng)過我國幾十個科研院所、百余名科研人員的研究與臨床實(shí)驗(yàn)表明，羅布麻（紅麻）葉具有清血脂、降血壓、解郁安神、清熱消炎、利尿消腫、抗氧化等功效，尤其降血壓功能比較顯著。羅布麻葉中富含黃酮類、有機(jī)酸、醇類、氨基酸、微量元素等活性物質(zhì)，大量試驗(yàn)表明黃酮類物質(zhì)是羅布麻葉中的主要活性成分之一[1-4]。總黃酮包括黃酮與黃酮醇類等，是具有苯駢呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的一類天然化合物總稱。目前，檢測總黃酮的方法有多種，研究發(fā)現(xiàn)不同的檢測方法測出羅布麻茶中的總黃酮含量不盡相同，有時還有較大差異[5-9]。試驗(yàn)采用硝酸鋁顯色對羅布麻茶中的總黃酮含量進(jìn)行檢測，以期為羅布麻茶的進(jìn)一步開發(fā)和研究提供參考[10-11]。

1 材料與方法

1.1 材料

羅布麻茶樣品來自于阿勒泰戈寶茶股份有限公司自生產(chǎn)的戈寶紅麻?羅布麻茶。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確吸取0，0.5，1.0，2.0，3.0和4.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL比色管中，加入30%乙醇液至5 mL，各加0.3 mL 5% NaNO2溶液，振搖后放置5 min，加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻后放置6 min，加2 mL 1.0 moL/L NaOH溶液，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，同時做空白，在510 nm處測定吸光度。

1.2.2 樣品處理[12-14]

取約1 g羅布麻茶試樣粉末，準(zhǔn)確稱定，倒入錐形瓶中，準(zhǔn)確加入25 mL 70%乙醇，稱其質(zhì)量，回流1 h，冷卻后，再次稱其質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻后過濾，取1 mL濾液于蒸發(fā)皿中，加1 g聚酰胺粉，水浴上待乙醇揮發(fā)后轉(zhuǎn)入層析柱。依次用20 mL石油醚、甲醇進(jìn)行洗脫，將洗脫液濃縮，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，定容。

1.2.3 樣品測定

準(zhǔn)確吸取2 mL供試品溶液于10 mL比色管中，加30%乙醇至5 mL，照1.2.1，自“0.3 mL加5% NaNO2溶液”起，依法測定吸光度，并根據(jù)回歸方程計算樣品中總黃酮的含量。

1.2.4 顯色劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇[15-17]

1.2.4.1 NaNO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)

吸取2 mL 150 μg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別加入0.5 mL 1%，3%，5%，7%和9% NaNO2溶液，其余同1.2.3。

1.2.4.2 Al(NO3)3質(zhì)量分?jǐn)?shù)

吸取2 mL 150 μg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別加入0.5 mL 2.5%，5%，7.5%，10%，12.5%和15% Al(NO3)3溶液，其余同1.2.3。

1.2.4.3 NaOH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)

吸取2 mL 150 μg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別加入4 mL 1.5%，2.5%，4%，5.5%和7% NaOH溶液，其余同1.2.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯色劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇

結(jié)果表明，NaNO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1%～5%范圍內(nèi)吸光度逐漸增加，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞5%時，吸光度有所下降，所以將NaNO2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)為5%；Al(NO3)3質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2.5%～10%范圍內(nèi)吸光度呈現(xiàn)不斷上升趨勢，隨后隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，吸光度開始下降，固將質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)為10%；NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1%～4%范圍內(nèi)吸光度逐漸增加，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞4%時，吸光度有所下降，故將質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)為4%。結(jié)果見圖1。

圖1 試劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇

2.2 提取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較

取1 g供試品，分別加30%，50%，70%和95%乙醇回流提取1 h。紫外分光光度法中并未明確提取乙醇體積分?jǐn)?shù)，通過表1可知，70%乙醇的提取效果最佳。

表1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.3 提取時間比較

取1 g供試品，分別加70%乙醇回流提取0.5，1，1.5和2 h。測定結(jié)果見表2。1 h提取已較完全，在相同的時間內(nèi)，回流提取比超聲提取率高。紫外分光光度法中采用超聲提取，從表2可看出，回流提取較超聲提取來說提取得更加充分。

表2 不同提取時間與總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線形關(guān)系考察

按1.2.1要求，測定結(jié)果見表3，繪制蘆丁質(zhì)量濃度（μg/mL）與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2。結(jié)果顯示，蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0012X+0.0031，R2=0.9997。

圖2 蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 精密度試驗(yàn)

取6份同一樣品，按前述方法測定總黃酮含量，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表4可知，總黃酮吸光度的SRSD為2.05%，顯示精密度良好。

表4 精密度試驗(yàn)測定結(jié)果（n=6）

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品，按前述方法測定總黃酮含量，每隔30 min進(jìn)行測定，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，顯色反應(yīng)后應(yīng)在30 min內(nèi)進(jìn)行測定。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)測定結(jié)果

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品，按前述方法分別制備6份供試品溶液，測定總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。由表6可知，總黃酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.83 mg/g，SRSD為2.60%，表明該測定方法的重復(fù)性良好。

表6 樣品重復(fù)性試驗(yàn)測定結(jié)果（n=6）

2.4.5 回收率試驗(yàn)

稱取6份樣品，每份1 g 左右，分別加入5.0 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，按前述方法測定總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計算回收率，結(jié)果見表7，蘆丁的平均回收率為99.1%。

表7 回收率測定結(jié)果（n=6）

2.4.6 專屬性試驗(yàn)

精確吸取4 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品溶液及空白樣品，按照1.2.3方法要求精確添加顯色劑后，分別在400～800 nm波長下進(jìn)行掃描，如圖3、圖4、圖5所示，在510 nm處標(biāo)準(zhǔn)品、樣品溶液有相同的吸收峰，空白樣品在510 nm下無吸收峰，表明測定方法對羅布麻茶種的總黃酮測定具有良好的專屬性。

圖3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品紫外光譜圖

圖4 樣品紫外光譜圖

圖5 空白溶液紫外光譜圖

2.4.7 耐用性試驗(yàn)

考察被測溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對測定結(jié)果的影響。由不同實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行操作，每人均取0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 g羅布麻粉末樣品，按照1.2.3方法進(jìn)行操作，測得樣品溶液在510 nm下的吸光度。從表8可以看出，隨著樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體呈上升趨勢。3組實(shí)驗(yàn)人員檢測出的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SRSD結(jié)果表明，試驗(yàn)條件具有良好的適應(yīng)性。

表8 溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對吸光度的影響

考察被測溶液的穩(wěn)定性對測定結(jié)果的影響。放置0 min，10 min，20 min，30 min，40 min，50 min，1 h，3 h，5 h和7 h后，按1.2.3方法測吸光度。由表9可知，待測溶液加入顯色劑后隨著時間的延長，吸光度整體呈下降趨勢，所以顯色后應(yīng)在1 h內(nèi)上機(jī)完成檢測，該方法選30 min內(nèi)上機(jī)檢測。

考察樣品提取時間對測定結(jié)果的影響。準(zhǔn)確稱取1 g羅布麻茶試樣粉末，置具塞錐形瓶中，加入25 mL 70%乙醇，靜置后稱其質(zhì)量，分別回流20，40，60，80和100 min，冷卻后，再稱其，剩下步驟同1.2.3“用70%乙醇補(bǔ)足質(zhì)量”后的方法，分別添加顯色劑后在510 nm下測定吸光度，結(jié)果見表10。

表10 提取時間對吸光度的影響

2.5 樣品的測定

分別稱取不同批次的羅布麻茶粉末，各1 g，按1.2.3小節(jié)的方法和《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范（2003版）》保健食品中總黃酮的測定方法分別進(jìn)行測定，計算其總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表11[18]。

表11 不同樣品測定總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)

結(jié)果顯示，2個方法測定的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)具有較大差異，基本在1.5倍左右。紫外分光光度法檢測的是黃酮類物質(zhì)特有的B環(huán)的肉桂?；Y(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)是黃酮物質(zhì)的主要活性部位，吸收峰在300～400 nm之間，硝酸鋁顯色法檢測的是所有具有鄰二位酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物，吸收峰在510 nm左右。紫外分光光度法直接對樣品進(jìn)行測定，具有一定的局限性，比較適合成分單一樣品的檢測，不能很好地代表羅布麻茶的品質(zhì)。因?yàn)榱_布麻茶中具有降血壓、降血脂等保健功效成分物質(zhì)除黃酮類物質(zhì)外，還含有大量其他物質(zhì)，如羥基苯甲酸類、綠原酸等酚類，這些物質(zhì)用紫外分光光度法是檢測不出來的[19]。

2.6 最低檢測限

按照1.2.3方法測定20次空白溶液的吸光度并計算檢測限，根據(jù)“檢測限（LOD）=3.3δ/S”計算。式中，δ表示被測液中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差；S表示標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。由表12可知，最低檢測線為4 μg/mL。

表12 試驗(yàn)方法得檢出限

3 結(jié)論及討論

3.1 討論

野生羅布麻（紅麻）于20世紀(jì)60年代在我國北緯33°～48°的鹽堿地域大量分布，由于人為破壞、環(huán)境惡化等原因，導(dǎo)致羅布麻（紅麻）至今在全國29個歷史分布區(qū)的邊緣地帶僅有零星殘存，只有全球距海岸最遠(yuǎn)的新疆阿勒泰鹽湖東戈壁尚存82041 m2，是我國當(dāng)今該植物最大的野生群落，羅布麻（紅麻）已瀕臨滅絕。因此，2006年，“拯救羅布麻 健康千萬家”工程被發(fā)起，以原生種大規(guī)模（1453 hm2）仿生種植?，F(xiàn)已成為羅布麻（紅麻）年產(chǎn)干葉高達(dá)1000 t的產(chǎn)能基地，占我國羅布麻（紅麻）資源的90%[20]。因此確定合適檢測方法，對羅布麻（紅麻）產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大的意義。

3.2 結(jié)論

試驗(yàn)方法的線性方程為Y=0.0012X+0.0031，R2=0.9997，線性關(guān)系良好；精密度試驗(yàn)SRSD為2.05%（n=6）；穩(wěn)定性試表明溶液配制好后應(yīng)在30 min內(nèi)上機(jī)比色；重復(fù)性試驗(yàn)顯示SRSD為2.60%（n=6）；回收率試驗(yàn)顯示回收率為99.1%（n=6）；專屬性試驗(yàn)表明該測定方法對羅布麻茶種的總黃酮測定具有良好的專屬性；從被測溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、不同檢測人員及環(huán)境、被測溶液的穩(wěn)定性、樣品的提取時間方面討論了檢測方法的耐用性，結(jié)果表明所設(shè)定的測定條件能夠滿足測定的需要，測定方法系統(tǒng)適用性良好，方法的檢出限為4 μg/mL。由此說明，用該方法測定羅布麻茶中的黃酮是可行的。

羅布麻茶用硝酸鋁顯色法進(jìn)行總黃酮檢測，該方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性好，能夠更好地代表羅布麻茶的保健功效。