許英一，劉迪，林巍，吳紅艷，王宇

1. 齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（齊齊哈爾 161006）；2. 黑龍江省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)分院（齊齊哈爾 161005）

燕麥中蛋白質(zhì)含量為11.19%～19.85%，其氨基酸均衡且比例穩(wěn)定，籽粒中蛋白含量明顯高于其他谷物[1]。燕麥蛋白是一種低過敏性的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，具有良好的營養(yǎng)特性，適合應(yīng)用于食品行業(yè)。但由于燕麥蛋白中球蛋白含量在50%～60%之間，溶解性較差，在一定程度上制約了乳化性、起泡性等其他功能特性，限制了其應(yīng)用[2]。熱處理是食品加工的常用方式，主要通過對蛋白熱聚集行為的影響達到影響其功能性質(zhì)及生物有效利用率的目的，從而拓寬其在食品工業(yè)中作為配料應(yīng)用的范圍。有研究發(fā)現(xiàn)熱處理是提高大豆蛋白功能特性如乳化性、起泡性、凝膠性的重要方式[3-4]。

蛋白質(zhì)的疏水作用是配位體間的非共價鍵相互作用，對蛋白質(zhì)的功能及穩(wěn)定性等有重要意義。表面疏水性是衡量分子間相互作用強弱的重要參數(shù)，不僅與加工方法及條件有關(guān)，還與蛋白質(zhì)的性質(zhì)密切相關(guān)[5]。許晶等[6]研究大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)特性與表面疏水性的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白的表面疏水性與溶解性呈負相關(guān)，與巰基含量呈正相關(guān)。樊永華[7]在研究改性醇法大豆?jié)饪s蛋白結(jié)構(gòu)與功能性的相關(guān)性分析時發(fā)現(xiàn)氨處理醇法大豆?jié)饪s蛋白的表面疏水性與溶解性、乳化性呈極顯著的線性正相關(guān)。但關(guān)于燕麥蛋白性質(zhì)與表面疏水性的關(guān)系研究在國內(nèi)外還鮮有報道。此次研究對堿溶酸沉法提取的燕麥蛋白進行熱處理改性，并測定其表面疏水性、巰基含量、熒光光譜分析、溶解性、乳化性，從而探究多種性質(zhì)與表面疏水性的關(guān)系，為改善燕麥蛋白性質(zhì)和拓展其應(yīng)用范圍奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

燕麥，由黑龍江省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)分院實驗基地提供；8-苯胺基-1-萘磺（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS），美國Sigma公司；氫氧化鈉、鹽酸、Tris、乙二胺四乙酸（EDTA）、尿素、2-硝基苯甲酸（DTNB）等均為分析純。

TDL-5-A臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；722S可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器，江蘇省金壇市醫(yī)療器械廠；RF530PC熒光分光光度計，日本島津；SHA-C水浴恒溫振蕩器，金壇市天竟實驗儀器廠；CR21G日立高速冷凍離心機，日立（日本）公司；ALPHA1-4/LSC真空冷凍干燥機，德國Christ公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 燕麥蛋白的制備[8]

采用堿溶酸沉法提取燕麥蛋白。

1.2.2 熱處理改性燕麥蛋白

配制質(zhì)量分數(shù)2%的燕麥蛋白的Tris-HCl緩沖溶液（0.01 mol/L、pH 9）。室溫下攪拌2 h，水化過夜，離心去除不溶性蛋白后得到上清蛋白溶液，記為OP。上清蛋白溶液分別在60，80和100 ℃水浴鍋中加熱30 min后冷卻、凍干，得到的產(chǎn)物分別記作OP1，OP2和OP3。

1.2.3 表面疏水性的測定

采用ANS熒光探針法進行表面疏水性指數(shù)的測定[9]，并略有改動。配制燕麥蛋白質(zhì)量濃度為0.4 g/L的磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7），按4000 r/min離心10 min，收集上清液。測定上清液中可溶性蛋白濃度，稀釋樣品溶液得系列濃度為0.00125，0.0025，0.005，0.01和0.02 g/L的樣品溶液。取4 mL系列稀釋溶液和20 μL 8 mmol/LANS溶液（8-苯胺基-1-萘磺酸）漩渦混合，在室溫下避光反應(yīng)15 min，測定混合液的熒光強度，激發(fā)波長及發(fā)射波長分別為390 nm和470 nm（狹縫寬5 nm），同時以未加入ANS溶液的蛋白溶液熒光強度為空白，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，熒光強度為縱坐標(biāo)作圖，線性回歸曲線初始斜率就是蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)（S0）。

1.2.4 巰基含量的測定

表面巰基含量的測定：采用Tris-甘氨酸緩沖液（Tris 0.086 mol/L，甘氨酸0.09 mol/L，EDTA 4 mmol/L，pH 8.0）制備質(zhì)量濃度為2 mg/mL的蛋白樣品，取6 mL蛋白樣品，加入0.02 mL Ellman’s 試液（0.2 g DTNB溶于50 mL緩沖液中）。室溫反應(yīng)15 min，按4000 r/min離心10 min，上清液在412 nm下測定吸光度，未添加試樣的則作空白[10]。

游離巰基含量的測定：將燕麥蛋白用Tris-甘氨酸緩沖液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，4 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素，pH 8.0）配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的蛋白樣品，后面步驟完全同表面巰基的測定方法。巰基含量（μmol/g）根據(jù)式（1）計算。

式中：73.53=106/（1.36×104），1.36×104為Ellman’s試劑的摩爾消光系數(shù)，L/（mol·cm）；A412為加DTNB時樣品的吸光度；D為稀釋系數(shù)；C為樣品的質(zhì)量濃度，mg/mL。

巰基暴露程度按式（2）計算。

1.2.5 內(nèi)源熒光光譜分析

參照王中江等[11]的測定方法。蛋白分散于pH 7磷酸鹽緩沖液中，蛋白質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，激發(fā)波長為295 nm，發(fā)射光譜范圍300～400 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，以未加樣品的磷酸鹽緩沖液為空白。

1.2.6 溶解性的測定

參照李開放等[12]的測定方法并稍做修改。稱取0.25 g樣品溶于25 mL蒸餾水中，在室溫下水浴振蕩30 min后離心（4000 r/min，30 min）。用移液管取3 mL上清液于另一試管中，加入2 mL雙縮脲試劑，混合均勻，靜置10 min，再次離心，取上清液用722分光光度計測定在540 nm處的吸光度，根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出上清液的蛋白含量。同時，凱氏定氮測定燕麥蛋白中的總蛋白含量，溶解度定義為上清液中蛋白濃度與總蛋白濃度的比值。

1.2.7 乳化性的測定

參照李翠翠等[13]的測定方法并稍作改動。將蛋白溶于0.1 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液，配制30 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的燕麥蛋白溶液，加入10 mL大豆色拉油，按10000 r/min均質(zhì)1 min。分別在0和10 min時從容器底部移取50 μL乳狀液，加到5 mL的0.1%的SDS溶液中，以0.1%的SDS溶液做空白，在500 nm處測其吸光度。乳化活性指數(shù)EAI（m2/g）通過公式（3）計算：

式中：DF為稀釋倍數(shù)；C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/mL；Φ為乳液中油相所占的體積分數(shù)，0.25%；L為比色池光徑，1 cm。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和處理采用SPSS V21.0軟件和Excel軟件。

2 結(jié)果與討論

以未改性的OP為對照，測定熱處理改性（OP1、OP2和OP3）和未改性O(shè)P的巰基、熒光光譜特性、溶解性、乳化性及表面疏水性等性質(zhì)。主要考察利用熱處理進行改性的燕麥蛋白部分性質(zhì)與表面疏水性之間的相關(guān)性。

2.1 熱處理改性燕麥蛋白表面疏水性分析

熱處理改性對燕麥蛋白表面疏水性的影響如圖1所示。與原蛋白相比，熱處理改性燕麥蛋白的表面疏水值顯著增加（p=0.018＜0.05）。在相同濃度條件下，隨著熱處理溫度的升高，表面疏水指數(shù)大幅升高，在100 ℃時（OP3）表面疏水指數(shù)達到最高，為218.37±3.45。這可能是因為適當(dāng)熱處理破壞了燕麥蛋白分子內(nèi)部的疏水相互作用，蛋白質(zhì)之間分子鏈展開，暴露出了更多的疏水基團，因此表面疏水性增加。

圖1 熱處理改性燕麥蛋白的表面疏水性

2.2 巰基含量與表面疏水性的相關(guān)性分析

熱處理改性燕麥蛋白表面巰基含量、巰基暴露程度與表面疏水性的相關(guān)性分析如圖2和圖3所示。相關(guān)性分析表明：表面疏水性與游離巰基含量的相關(guān)系數(shù)r為0.084，r＜r0.05（0.632），表面疏水性和表面巰基含量的相關(guān)系數(shù)r為0.959，r＞r0.01，表面疏水性和巰基暴露程度相關(guān)系數(shù)r為0.806，r＞r0.01，說明表面疏水性和游離巰基含量相關(guān)性不顯著，但與表面巰基含量、巰基暴露程度呈極顯著的線性正相關(guān)關(guān)系，這與李丹等[14]不同大豆品種11S球蛋白結(jié)構(gòu)特性與表面疏水性關(guān)系研究結(jié)果一致。

圖2 表面巰基濃度與表面疏水性的相關(guān)性分析

圖3 巰基暴露程度與表面疏水性的相關(guān)性分析

2.3 內(nèi)源熒光強度與表面疏水性的相關(guān)性分析

熱處理改性燕麥蛋白的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜如圖4所示。在λmax相同（λmaxOP=λmaxOP1=λmaxOP2=321 nm）的情況下，色氨酸殘基暴露程度越大，熒光強度越高，其表面疏水性就越高。由圖4可知，在同一波長下，熱處理溫度80 ℃燕麥蛋白（OP2）比熱處理溫度60 ℃燕麥蛋白（OP1）的熒光強度低，分析原因可能是熱處理溫度升高會導(dǎo)致燕麥蛋白的柔性增加，從而使更多的發(fā)色團暴露于試劑中發(fā)生熒光猝滅，所以熒光強度降低。但100 ℃熱處理的燕麥蛋白（OP3）熒光強度最大，可能是因為熱處理溫度繼續(xù)升高使燕麥蛋白分子形成較大聚集體所致，這與王健等[15]的研究結(jié)果相一致。熱處理改性燕麥蛋白色氨酸殘基相對熒光強度與表面疏水性的相關(guān)性分析如圖5所示，色氨酸殘基相對熒光強度與表面疏水性的相關(guān)系數(shù)r為0.819，r＞r0.01，兩者呈極顯著的正相關(guān)。

圖4 內(nèi)源熒光光譜分析

圖5 內(nèi)源熒光強度與表面疏水性的相關(guān)性分析

2.4 溶解性與表面疏水性的相關(guān)性分析

熱處理改性燕麥蛋白的溶解性與表面疏水性的相關(guān)性分析如圖6所示。二者之間的相關(guān)系數(shù)r為0.939，r＞r0.01，表明兩者呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系。Bigelow[16]認為溶解性本身受到表面疏水性和電荷頻率兩個參數(shù)的影響，高電荷頻率、低表面疏水性可以有效提高溶解度。但此次試驗通過熱處理改性，會同時改變電荷頻率、疏水性和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使這種相關(guān)性不再存在。結(jié)果顯示，溶解度隨表面疏水性的增加而變大，這可能是由于電荷頻率對燕麥蛋白溶解度的影響遠遠大于表面疏水性的作用[17]。

圖6 溶解性與表面疏水性的相關(guān)性分析

2.5 乳化性與表面疏水性的相關(guān)性分析

熱處理改性燕麥蛋白的乳化性與表面疏水性的相關(guān)性分析如圖7所示。二者之間的相關(guān)系數(shù)r為0.820，r＞r0.01，表明兩者之間存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系。乳化性是指將油和水混合在一起形成乳狀液的性能，是蛋白質(zhì)的一項重要指標(biāo)。蛋白質(zhì)的乳化性不僅與其分子的疏水性質(zhì)有關(guān)，還與疏水基團在分子中的分布有關(guān)。熱處理改性使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，隱藏的疏水基團逐漸暴露出來，表面疏水性變大有利于蛋白質(zhì)和油滴的結(jié)合，其乳化性得到改善[18]。

圖7 乳化性與表面疏水性的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

熱處理改性燕麥蛋白的表面巰基含量與表面疏水性呈極顯著正相關(guān)（r=0.959）、與巰基暴露程度呈極顯著正相關(guān)（r=0.806），而與游離巰基含量相關(guān)性不顯著。熱處理改性燕麥蛋白的色氨酸殘基相對熒光強度與表面疏水性呈極顯著正相關(guān)（r=0.819），即色氨酸殘基暴露程度越大，表面疏水性越高。熱處理改性燕麥蛋白的溶解性與表面疏水性呈極顯著正相關(guān)（r=0.939）、乳化性與表面疏水性呈極顯著正相關(guān)（r=0.820）。