趙志平，康馨樾，張鈺麟，王衛(wèi)，吉莉莉，張佳敏

成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都 610106）

臘腸是中國(guó)傳統(tǒng)肉制品，色澤誘人，具有獨(dú)特的風(fēng)味和口感，深受人們喜愛。脂肪和蛋白質(zhì)是臘腸的重要組成部分，脂肪和蛋白質(zhì)的適度氧化是臘腸風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的主要來源，對(duì)臘腸的品質(zhì)起決定性作用。脂肪適度氧化后產(chǎn)生小分子的揮發(fā)性物質(zhì)是醛類、烴類、醇類、酸類及酮類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的重要來源，對(duì)改善臘腸等肉制品的風(fēng)味具有極其重要的作用[1-2]。蛋白質(zhì)的適度降解可以產(chǎn)生小肽及氨基酸等物質(zhì)，在提升臘腸等肉制品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值方面發(fā)揮重要作用[3]。然而，臘腸脂肪、蛋白質(zhì)過度氧化，尤其是脂肪過度氧化會(huì)造成酸敗，導(dǎo)致臘腸品質(zhì)大幅降低，消費(fèi)者不再認(rèn)可[4]。加工臘腸時(shí)添加亞硝酸鹽不僅可以有效抑制脂肪和蛋白質(zhì)氧化分解，也可以改善臘腸的風(fēng)味[5]。但亞硝酸鹽毒性較強(qiáng)，可與生物胺反應(yīng)生成具有強(qiáng)致癌作用的亞硝胺，影響臘腸的食用安全性。

除硝酸鹽和亞硝酸鹽外，使用微生物發(fā)酵劑或天然植物提取物也能有效抑制肉制品脂肪和蛋白質(zhì)氧化。張學(xué)穎等[6]使用植物乳桿菌X3-9和干酪乳桿菌X3-12作為發(fā)酵劑生產(chǎn)羊肉香腸，研究發(fā)現(xiàn)添加發(fā)酵劑的羊肉香腸的TBARs值比對(duì)照組更低。曹辰辰等[7]使用植物乳桿菌和模仿葡萄球菌作為混合發(fā)酵劑制作發(fā)酵香腸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)功能發(fā)酵劑能夠顯著降低香腸的TBARs值和巰基值，提高羰基值，表明脂肪和蛋白質(zhì)氧化得到顯著抑制。植物提取物如茶多酚、桂皮提取物等能顯著抑制肉制品脂肪氧化[8-9]。香腸中添加0.6%桂皮提取物效果與0.02%二丁基羥基甲苯相當(dāng)，能夠有效抑制中式香腸TBA值和羰基值的升高，并且改善香腸的品質(zhì)[8]。研究表明，辣椒籽提取物能夠顯著抑制冷卻肉TBARs值和POV值的升高，并且延長(zhǎng)冷卻肉的貨架期[10]。

類球紅細(xì)菌分布廣泛，生命力強(qiáng)，易于培養(yǎng)，富含類胡蘿卜素、輔酶Q10、超氧化物岐化酶、維他命等天然活性物質(zhì)，在食品、醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[11-12]。類球紅細(xì)菌基因組含有一套完整的合成類胡蘿卜素和輔酶Q10的代謝途徑，在合適的生長(zhǎng)代謝條件下能夠大量合成天然類胡蘿卜素和輔酶Q10[13-14]。類球紅細(xì)菌自身還編碼多種與抗氧化相關(guān)的蛋白質(zhì)，趙志平等[15]研究發(fā)現(xiàn)類球紅細(xì)菌OmpR家族蛋白OmpR-1在其抗氧化脅迫過程中發(fā)揮重要作用。此外，類球紅細(xì)菌作為益生菌有著廣泛的應(yīng)用前景，被廣泛用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖[16-17]?；陬惽蚣t細(xì)菌富含類胡蘿卜素和輔酶Q10等天然抗氧化活性物質(zhì)，試驗(yàn)將類球紅細(xì)菌粗提物作為臘腸加工的輔料抑制臘腸脂肪和蛋白質(zhì)氧化，為利用類球紅細(xì)菌代謝物改善肉制品品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

類球紅細(xì)菌Rhodobactersphaeroides（實(shí)驗(yàn)室保存）；豬肉（四川高金實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

YP302N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；PHS-3C-01型pH計(jì)（上海三信儀表廠）；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6（常州澳華儀器有限公司）；HC-2518臺(tái)式高速離心機(jī)（湘儀設(shè)備有限公司）；UV-1801紫外可見分光光度計(jì)（北京北分瑞利有限公司）；EPED-E2-10TJ超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；756PC型生化培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）；DHP-9160B通用型超凈工作臺(tái)（上海舜宇平科學(xué)儀器有限公司）；立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器GR60DA（致微（廈門）儀器有限公司）；立式雙層全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器SPH-2102C（上海程造儀器設(shè)備有限公司）；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)Scientz-650E（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 類球紅細(xì)菌的培養(yǎng)

將-80 ℃保存的類球紅細(xì)菌劃線培養(yǎng)于R?固體培養(yǎng)基上[18]，在30 ℃培養(yǎng)3 d長(zhǎng)出紅色單菌落，挑取紅色單菌落接種到R?液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至A660nm= 0.4～0.8。將活化的類球紅細(xì)菌按2%接種到錐形瓶中，30 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3.2 類球紅細(xì)菌粗提物的制備

將培養(yǎng)的類球紅細(xì)菌在離心力7000g，4 ℃條件下離心10 min。按1 L菌用10 mL生理鹽水的比例重懸后超聲波破碎。超聲波破碎條件為：功率200 W，總時(shí)間20 min，工作6 s，停歇7 s。超聲后，在離心力8000g，4 ℃條件下離心10 min收集上清即為類球紅細(xì)菌粗提物。

1.3.3 臘腸制作工藝

原料肉處理→肥肉瘦肉均切細(xì)絲→混料（前夾肉，W瘦肉∶W肥肉=7∶3、味精1.5%（W/W）、食鹽2%（W/W）、十三香3%（W/W））→每1 kg肉加入1 L類球紅細(xì)菌的粗提物混勻→灌腸→成熟風(fēng)干（白天12 ℃，晚上8 ℃，相對(duì)濕度70%～80%）。以生理鹽水代替類球紅細(xì)菌粗提物制作的臘腸作為對(duì)照，對(duì)照和樣品均不適用亞硝酸鹽。

1.3.4 TBA測(cè)定

TBA測(cè)定采用GB 5009.181—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中丙二醛的測(cè)定》中的分光光度法。

1.3.5 羰基值測(cè)定

稱取5 g去掉肥肉并絞碎的豬肉樣品，在20 mL預(yù)冷的提取液（10 mmol/L磷酸鹽緩沖液，含100 mmol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EDTA，pH 7.0）中勻漿60 s。吸取1 mL勻漿液到10 mL EP管中，每管加入1 mL 10 mmol/L的DNPH溶液（2 mol/L HCl為溶劑）在室溫下避光反應(yīng)1 h。將另外1 mL勻漿液與1 mL 2 mol/L HCl（對(duì)照）混合。孵育后，加入1 mL 20% TCA，并將混合物以10000 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清液。用1 mL乙酸乙酯-乙醇（1∶1，V/V）洗滌沉淀3次，加入3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液，37 ℃孵育15 min后10000 r/min，4 ℃離心5 min，在370 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液的吸光度。根據(jù)式（1）計(jì)算羰基值，表示為nmol羰基/mg蛋白。

式中：A370nm為370 nm下的吸光度；2.2×104L/（mol·cm）為摩爾吸光系數(shù)；106為單位換算系數(shù)；C為用考馬斯亮藍(lán)法在595 nm下測(cè)得的勻漿液蛋白濃度。

1.3.6 總巰基值的測(cè)定

依據(jù)DTNB法，吸取1 mL羰基測(cè)定中的勻漿液，與8 mL Tris-甘氨酸溶液（每升該溶液中含有10.4 g Tris、6.9 g甘氨酸、1.2 g EDTA、8 mol尿素，pH 8）混合均勻，均質(zhì)60 s，然后按10000 r/min，4 ℃離心15 min。吸取上清液4.5 mL與0.5 mL 10 mmol/L 5, 5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）混合（DTNB）。在40 ℃水浴中孵育30 min。在412 nm處測(cè)定上清液的吸光度。根據(jù)式（2）計(jì)算總巰基值，表示為nmol巰基/mg蛋白。

式中：A412nm為412 nm下的吸光度；1.36×104為摩爾吸光系數(shù)；106為單位轉(zhuǎn)換系數(shù)；C為用考馬斯亮藍(lán)法在595 nm下測(cè)得的勻漿液蛋白濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 風(fēng)干期臘腸TBARs值的測(cè)定

臘腸風(fēng)干期間TBARs值的變化如圖1所示。隨著風(fēng)干時(shí)間延長(zhǎng)，樣品和對(duì)照的TBARs值都呈上升趨勢(shì)。風(fēng)干第2天時(shí)，對(duì)照和樣品的TBARs值沒有顯著性差別，說明風(fēng)干2 d時(shí)脂肪氧化沒有顯著性差異。但從第4天開始，對(duì)照和樣品的TBARs值出現(xiàn)顯著性差異，并且差異越來越大。樣品TBARs值在風(fēng)干過程中上升比較緩慢，樣品0 d和2 d、2 d和4 d、4 d和6 d、8 d和10 d的TBARs值對(duì)比沒有發(fā)生顯著性變化（p＞0.05），但6 d和8 d的TBARs值有顯著性變化（p＜0.01）。而對(duì)照0 d與2 d，4 d和6 d之間的TBARs值沒有顯著性變化，2 d和4 d、6 d和8 d、8 d和10 d之間有顯著性差異（p＜0.01）。對(duì)照和樣品TBARs值在風(fēng)干期的變化趨勢(shì)及變化速率表明，對(duì)照脂肪氧化的速度明顯快于樣品脂肪氧化的速度，說明類球紅細(xì)菌粗提物有效抑制臘腸的脂肪氧化。類球紅細(xì)菌粗提物中含有豐富的類胡蘿卜素、輔酶Q10等抗氧化活性物質(zhì)，在臘腸風(fēng)干過程中有效發(fā)揮抗氧化作用從而抑制臘腸脂肪氧化，但類球紅細(xì)菌粗提物的添加對(duì)臘腸內(nèi)源性脂肪酶活性的影響需要進(jìn)一步探究。

圖1 對(duì)照和樣品臘腸風(fēng)干期間TBARs值的變化情況

2.2 風(fēng)干期臘腸羰基值的測(cè)定

羰基值是反映蛋白質(zhì)氧化的重要指標(biāo)之一，能反映出蛋白質(zhì)的氧化程度，羰基值越高說明蛋白質(zhì)氧化程度就越高。從圖2可以看出，隨著風(fēng)干時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照和樣品臘腸的羰基值都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并且從風(fēng)干第2天開始，對(duì)照的羰基值和樣品的羰基值存在顯著性變化（p＜0.01），表明類球紅細(xì)菌粗提物在風(fēng)干過程中顯著抑制臘腸蛋白質(zhì)氧化。雖然樣品羰基值也表現(xiàn)出逐步上升趨勢(shì)，但風(fēng)干0 d和2 d、4 d和6 d、6 d和8 d、8 d和10 d相比，羰基值沒有發(fā)生顯著性變化（p＞0.05），只有風(fēng)干2 d和4 d的相比發(fā)生顯著性變化（p＜0.05）。對(duì)照羰基值在風(fēng)干期間的變化比較顯著，0 d和2 d、2 d和4 d相比發(fā)生顯著性變化（p＜0.01），6 d和8 d相比也發(fā)生顯著性變化（p＜ 0.05），而4 d和6 d、8 d和10 d相比沒有發(fā)生顯著性變化（p＞0.05）。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，類球紅細(xì)菌粗提物有效延緩臘腸蛋白質(zhì)的氧化，但類球紅細(xì)菌粗提物對(duì)臘腸內(nèi)源性蛋白酶活性的影響需要進(jìn)一步探究。

圖2 對(duì)照和樣品臘腸風(fēng)干期羰基值的變化

2.3 風(fēng)干期臘腸總巰基值的測(cè)定

總巰基值是反映蛋白質(zhì)未被氧化的指標(biāo)，總巰基值越高，說明未被氧化的蛋白質(zhì)越多，表明蛋白質(zhì)氧化的程度越低。從圖3可以看出，在臘腸風(fēng)干期間，隨著風(fēng)干時(shí)間延長(zhǎng)，總巰基值越來越低，表明臘腸蛋白質(zhì)氧化程度越來越高。從風(fēng)干第4天開始，對(duì)照的總巰基值顯著性低于樣品的總巰基值（p＜0.01），表明樣品臘腸的蛋白質(zhì)氧化程度顯著低于對(duì)照臘腸蛋白質(zhì)氧化程度，說明類球紅細(xì)菌粗提物有效抑制臘腸蛋白質(zhì)氧化。此外，對(duì)照總巰基值降低的速度快于樣品組。樣品總巰基值在風(fēng)干過程中下降緩慢，0 d和2 d、2 d和4 d、4 d和6 d、6 d和8 d、8 d和10 d的總巰基值沒有顯著性變化（p＞0.05）。而對(duì)照0 d和2 d、8 d和10 d之間的總巰基值存在極顯著性差異（p＜ 0.01），2 d和4 d、4 d和6 d、6 d和8 d之間也存在顯著性差異（p＜0.05），說明對(duì)照的總巰基值在風(fēng)干期的不同階段均顯著降低，對(duì)照蛋白質(zhì)氧化的速度明顯快于樣品蛋白質(zhì)的氧化速度。

圖3 對(duì)照組和樣品組臘腸風(fēng)干期總巰基值的變化

2.4 風(fēng)干期臘腸微生物總菌數(shù)、pH和水分活度的測(cè)定

肉制品脂肪和蛋白質(zhì)氧化與微生物尤其是腐敗菌有密切關(guān)系。樣品和對(duì)照臘腸的總菌計(jì)數(shù)結(jié)果如圖4～圖6所示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析顯示，風(fēng)干期對(duì)照臘腸和樣品臘腸的總菌數(shù)沒有顯著性差異（p＞0.05），這與風(fēng)干期對(duì)照臘腸和樣品臘腸的水分活度沒有顯著性差異結(jié)果一致（p＞0.05），初步說明對(duì)照和樣品臘腸脂肪和蛋白質(zhì)氧化的顯著性差異與微生物總數(shù)之間沒有必然關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步表明類球紅細(xì)菌粗提物能夠有效抑制臘腸脂肪和蛋白質(zhì)氧化。但在風(fēng)干期間，樣品的pH始終顯著高于對(duì)照的pH（p＜0.05），這可能與類球紅細(xì)菌粗提物呈弱堿性（約pH 8.0）有關(guān)，樣品臘腸pH的提高對(duì)蛋白酶和脂肪酶的活性需作進(jìn)一步研究。

圖4 對(duì)照組和樣品組臘腸風(fēng)干期微生物總菌數(shù)的變化

圖5 對(duì)照組和樣品組臘腸風(fēng)干期水分活度的變化

圖6 對(duì)照組和樣品組臘腸風(fēng)干期pH的變化

3 結(jié)論

試驗(yàn)探究類球紅細(xì)菌粗提物對(duì)風(fēng)干期臘腸脂肪和蛋白質(zhì)氧化的影響。類球紅細(xì)菌粗提物富含類胡蘿卜素、輔酶Q10等天然抗氧化活性物質(zhì)，試驗(yàn)結(jié)果表明類球紅細(xì)菌粗提物有效抑制臘腸脂肪和蛋白質(zhì)氧化（p＜0.01），但對(duì)風(fēng)干期臘腸的微生物總菌數(shù)、水分活度和pH沒有顯著性影響（p＞0.05）。類球紅細(xì)菌粗提物對(duì)臘腸內(nèi)源性脂肪酶和蛋白酶活性的影響及其抑制臘腸脂肪和蛋白質(zhì)氧化的機(jī)理尚需進(jìn)一步探討。類胡蘿卜素、輔酶Q10等天然活性物質(zhì)在食品、醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用，試驗(yàn)結(jié)果為利用類球紅細(xì)菌改善肉制品品質(zhì)提供理論依據(jù)。