劉承毅，吳雪輝,

1. 華南農(nóng)業(yè)大學食品學院（廣州 510642）；2. 廣東省油茶工程技術研究中心（廣州 510642）

油茶（Camellia oleifera），是我國重要的木本油料作物。目前，我國油茶種植面積已達到440萬 hm2，并且有逐年增長的趨勢[1]。油茶果殼是油茶果去仁后留下的外種皮，在制油過程中，1 t的油茶果實能產(chǎn)生大約0.54 t的果殼[2]，然而在實際中，果殼常常被當作廢料處理或者冬天取暖用的燃料，利用率極低[3]。

原花青素（Proanthocyanidins），由一類黃烷醇單體聚合形成的多酚類物質[4]，是一種天然的強抗氧化劑[5]，同時還具有降血糖、抗腫瘤、抗衰老等作用[6-8]，應用前景廣闊。近年來，研究發(fā)現(xiàn)油茶果殼中含有豐富的原花青素，含量在2%～5%左右[9-10]。目前對果殼中原花青素的研究主要集中在提取上，但獲得的粗提物中含有較多雜質，需要進一步純化。大孔樹脂法因其具有易操作、選擇性強等優(yōu)點，常被應用于原花青素吸附純化研究[11-12]。

通過抑制體內α-淀粉酶的活性，可以阻斷淀粉等碳水化合物在體內轉變糊精和寡糖的過程，減少碳水化合物的攝入，避免餐后血糖的快速升高，對控制血糖及治療糖尿病有著重要意義[13]。研究表明，從植物中提取的原花青素可以通過抑制碳水化合物水解酶如α-淀粉酶的活性來預防高血糖[14]。

目前，關于油茶果殼中原花青素的純化及其對α-淀粉酶活性抑制作用的研究均未見報道。因此，利用大孔樹脂對油茶果殼中原花青素進行純化，同時考察純化后原花青素對α-淀粉酶活性的抑制作用，以期為油茶果殼的高值化利用和原花青素的研究開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶果（采自東莞樟木頭林場）；大孔樹脂S-8、HPD-600、AB-8、D-101、XDA-6、LSA-12、LX-213（西安藍曉科技新材料股份有限公司）；原花青素標準品（純度≥95%，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司）；阿卡波糖（上海伊卡生物技術有限公司）；豬胰α-淀粉酶（10 U/mg，美國Sigma-Aldrich公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV-5200型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；JJ1000型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；HWS24型電熱恒溫水浴鍋（廣州航信科學儀器有限公司）；LRH-150B恒溫培養(yǎng)箱（廣東泰宏君科學儀器股份有限公司）；HY-5回旋式振蕩器（常州澳華儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 油茶果殼原花青素的提取

油茶果殼于45 ℃烘干，粉碎后過0.425 mm篩，備用。準確稱取10.00 g樣品，加入500 mL 43%（V/V，下同）乙醇溶液，于70 ℃提取13 min，抽濾，真空濃縮，得到原花青素粗提液。

1.2.2 原花青素標準曲線的制作及純度的測定

原花青素質量濃度的測定參考孫蕓等[15]的方法，以原花青素質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線y=2.63x+0.0394，R2=0.9991。

式中：C為測得的原花青素質量濃度，mg/mL；V為樣液體積，mL；n為樣品稀釋倍數(shù)；m為原花青素純化物干基質量，mg。

1.2.3 樹脂的預處理

樹脂于95%乙醇浸泡24 h，用蒸餾水洗至無醇味。依次用4倍體積的5% HCl溶液和4倍體積的5% NaOH溶液各浸泡4 h，用蒸餾水洗至中性，濾干，備用。

1.2.4 靜態(tài)吸附和解吸實驗

分別稱取1.00 g不同型號的大孔樹脂（S-8、HPD-600、LSA-12、XDA-6、AB-8、LX-213、D-101）置于錐形瓶中，加入40 mL質量濃度為1.24 mg/mL的原花青素粗提液，置于恒溫搖床（25 ℃，120 r/min）中振蕩24 h，測定吸附飽和后溶液中原花青素質量濃度。于上述飽和樹脂加入40 mL 95%乙醇，振蕩解吸24 h（25 ℃，120 r/min），測定解吸液中原花青素質量濃度。按式（2）～（4）計算吸附率、解吸率和回收率。

式中：C0、C1和C2分別為提取液原花青素質量濃度、吸附平衡原花青素質量濃度和解吸平衡原花青素質量濃度，mg/mL。

1.2.5 動態(tài)吸附與解吸試驗

稱取7.00 g樹脂濕法裝柱，固定上樣質量濃度0.95 mg/mL，分別以0.25，0.50，0.75，1.00和1.25 mL/min的流速加入150 mL待上樣液進行吸附，收集流出液并測定原花青素質量濃度，繪制不同流速下樹脂的動態(tài)吸附曲線，計算吸附率和泄漏時間。在最佳上樣流速條件下，分別考察乙醇洗脫體積分數(shù)（10%，30%，50%，70%和90%）、上樣質量濃度（0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 mg/mL）和洗脫流速（0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 mL/min）對原花青素解吸效果的影響，收集流出液并測定原花青素質量濃度，繪制不同條件下樹脂動態(tài)解吸曲線并計算回收率。真空干燥洗脫液，得原花青素純化物，測定純化物純度。

1.2.6 油茶果殼原花青素對α-淀粉酶活性的抑制作用

1.2.6.1 原花青素對α-淀粉酶活性的抑制曲線

參考鐘英英等[16]的方法，以阿卡波糖為陽性對照，測定不同質量濃度抑制劑對α-淀粉酶活性的抑制率?；谝种苿┵|量濃度和抑制率回歸方程計算IC50值（半抑制質量濃度）。

1.2.6.2 原花青素對α-淀粉酶抑制類型的研究

配制0.40，0.80，1.20，1.60和2.00 mg/mLα-淀粉酶溶液，抑制組原花青素質量濃度為0.30 mg/mL，非抑制劑組用緩沖液代替原花青素溶液，按照1.2.6.1的方法測定反應后溶液吸光度，以酶質量濃度對反應速率作圖，判斷原花青素對α-淀粉酶的抑制類型。

配制0.20%，0.60%，1.00%，1.40%和1.80%淀粉溶液，抑制組原花青素質量濃度為0.30 mg/mL，非抑制劑組用緩沖液代替原花青素溶液，按照1.2.6.1方法測定反應后溶液吸光度，作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，確定原花青素對α-淀粉酶可逆抑制類型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019進行數(shù)據(jù)分析，Origin 2018軟件進行作圖及方程擬合。

2 結果與分析

2.1 靜態(tài)吸附和解吸實驗

圖1為7種型號大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸試驗結果。吸附率較高的樹脂型號有S-8、XDA-6、AB-8，其中：S-8樹脂吸附率最高，但解吸率和回收率很低；XDA-6樹脂吸附率其次，且回收率最高；AB-8解吸率較高，但吸附率和回收率較差。綜合考慮，選擇XDA-6型號樹脂作為純化樹脂。

圖1 不同型號樹脂對原花青素靜態(tài)吸附與解吸結果

2.2 動態(tài)吸附與解吸試驗

2.2.1 上樣流速對樹脂吸附原花青素的影響

圖2為上樣流速對樹脂吸附原花青素的影響，泄露時間和回收率均隨著上樣流速的增大而減小。當流出液質量濃度達到上樣液質量濃度的10%時，該質量濃度稱為樹脂吸附泄露點[17]。上樣流速過快，會使目標產(chǎn)物與樹脂接觸不充分，容易造成樹脂過載而泄露[18]；上樣流速過慢，會造成上樣時間過長。相比于0.25 mL/min，以0.5 mL/min流速上樣時，泄露時間從520 min減小到180 min，而回收率僅減少4.11%，因此選擇上樣流速0.5 mL/min。

圖2 上樣流速對樹脂吸附原花青素的影響

2.2.2 洗脫體積分數(shù)對樹脂解吸原花青素的影響

圖3為洗脫體積分數(shù)對樹脂解吸原花青素的影響。10%乙醇洗脫時，原花青素的回收率和純度均較低，表明10%乙醇對原花青素的選擇性不強。原因是10%乙醇極性較大，而原花青素極性較低[19]，10%乙醇無法將原花青素從樹脂中洗脫出來，洗脫物中多是極性較大的雜質。30%乙醇洗脫物，純度較高，但會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，50%～90%乙醇洗脫峰型較窄，成分集中，且回收率和純度均較高，表明乙醇體積分數(shù)超過50%后，均能較好地洗脫出樹脂中原花青素。綜合成本考慮，選擇50%乙醇作為洗脫劑。

圖3 洗脫體積分數(shù)對樹脂解吸原花青素的影響

2.2.3 上樣質量濃度對樹脂吸附原花青素的影響

圖4為上樣質量濃度對樹脂吸附原花青素的影響。在不同上樣質量濃度下，原花青素洗脫曲線變化相似，且隨上樣質量濃度的增大，峰尖濃度依次增大。上樣質量濃度在0.5～1.5 mg/mL范圍內時，回收率緩慢下降，超過1.5 mg/mL后急速下降，原因是原花青素濃度增大，樹脂表面基團逐漸飽和，傳質速度變慢[20]，上樣質量濃度超過1.5 mg/mL后，部分原花青素未被吸附就流出，回收率快速降低。原花青素純度先上升后降低，在上樣質量濃度為1.5 mg/mL時達到最大，與鄭洪亮[21]研究中紅皮云杉球果原花青素純度隨上樣質量濃度的變化趨勢相同。最終選擇上樣質量濃度1.5 mg/mL。

圖4 上樣質量濃度對樹脂吸附原花青素的影響

2.2.4 洗脫流速對樹脂解吸原花青素的影響

圖5為洗脫流速對樹脂解吸原花青素的影響。隨著洗脫流速的增大，峰尖濃度減?。患兌入S洗脫流速的增大，持續(xù)減小，在流速超過1.00 mL/min后快速下降；回收率先增大后減小，并在1.5 mL/min時達到最大值。流速從1.00 mL/min到1.50 mL/min，純度相對下降較多，而回收率增加不多。綜合考慮，最佳洗脫流速選擇1.0 mL/min，在此條件下，原花青素純度達到53.41%，相比于粗提物純度14.82%，純化物純度提高了3.6倍。

圖5 洗脫流速對樹脂解吸原花青素的影響

2.3 油茶果殼原花青素抑制α-淀粉酶活性試驗

2.3.1 原花青素對α-淀粉酶活性的抑制曲線

圖6為油茶果殼原花青素對α-淀粉酶活性的抑制曲線。原花青素質量濃度為0.08～0.40 mg/mL時，抑制率迅速上升；0.40～1.00 mg/mL范圍內，抑制率上升速度變緩；質量濃度超過1.00 mg/mL后，抑制率趨于穩(wěn)定，并在2.00 mg/mL達到最大值95.36%，高于對照物阿卡波糖（90.93%）。通過對圖中抑制劑濃度和抑制率的關系進行擬合，計算得到原花青素IC50值為0.24 mg/mL，低于對照物阿卡波糖IC50值（0.27 mg/mL）。圖6顯示，油茶果殼原花青素對α-淀粉酶活性的抑制效果與質量濃度呈現(xiàn)正量效關系。最大抑制率和IC50值均表明油茶果殼原花青素比阿卡波糖有更好的抑制效果。

圖6 原花青素對α-淀粉酶活性的抑制曲線

2.3.2 原花青素對α-淀粉酶抑制類型的研究

圖7為原花青素對α-淀粉酶活性的抑制動力學曲線。在酶質量濃度與反應速率相互關系中可以發(fā)現(xiàn)，抑制劑組的直線斜率低于非抑制組，并且抑制組和非抑制組直線均經(jīng)過原點。根據(jù)酶反應動力學曲線特征[22]，油茶果殼原花青素對α-淀粉酶活性的抑制作用為可逆性抑制。

圖7 原花青素對α-淀粉酶的抑制動力學曲線

圖8為原花青素對α-淀粉酶抑制作用的雙倒數(shù)圖。結果發(fā)現(xiàn)，抑制劑組和非抑制劑組兩條直線相較于Y軸，在有抑制劑存在時，Km值增大，Vmax值不變，表明原花青素對α-淀粉酶的可逆抑制類型屬于競爭性抑制。此時，酶抑制劑和底物在結構上有相似之處，酶抑制劑與酶的結合阻斷了底物與酶的結合，降低了酶和底物的親和能力，酶反應的速率減慢[23]，與劉睿等[22]研究的高粱原花青素對α-淀粉酶的抑制類型一致。

圖8 原花青素對α-淀粉酶抑制作用的雙倒數(shù)圖（Lineweaver-Burk）

3 結論

探究了油茶果殼中原花青素的純化工藝條件，并考察純化后的原花青素對α-淀粉酶活性的抑制作用。采用XDA-6大孔樹脂樹脂，在上樣流速0.50 mL/min、洗脫乙醇體積分數(shù)50%、上樣質量濃度1.50 mg/mL、洗脫流速1.00 mL/min條件下進行純化，原花青素純度達到53.41%，純度相比于粗提物（14.82%）提高了3.6倍。油茶果殼原花青素對α-淀粉酶活性的抑制率可達到95.36%，IC50值為0.24 mg/mL，原花青素通過可逆的競爭性作用實現(xiàn)對α-淀粉酶活性的抑制。研究純化的原花青素能夠有效抑制α-淀粉酶的活性，抑制效果超過阿卡波糖，有望作為膳食補充劑應用于血糖控制及糖尿病的防治。