劉俊紅，樊媛芳，張苗玉，朱玉涵，洪軍，王錕宇

1. 河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院（平頂山 467044）；2. 中國礦業(yè)大學(xué)電力與動力工程學(xué)院（徐州 221116）

蘋果富含礦物質(zhì)和維生素，是公認(rèn)的營養(yǎng)程度較高的健康水果之一，因而受到廣大消費者的喜愛。蘋果在加工過程中，果肉暴露于空氣中易氧化變質(zhì)，對產(chǎn)品的品質(zhì)有較大影響。因此，對鮮切蘋果的保鮮技術(shù)的研究至關(guān)重要。

超聲波是一種機(jī)械振動在媒質(zhì)中的傳播過程，其頻率一般在20 kHz以上[1]。超聲波主要具有機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化效應(yīng)，其中空化效應(yīng)具有殺菌效力?？栈?yīng)由低頻高能量的超聲波在液體中產(chǎn)生，能夠破壞微生物的細(xì)胞壁，使微生物細(xì)胞內(nèi)容物受到強(qiáng)烈振蕩，從而能夠殺死微生物[2]。超聲波處理不會對果蔬產(chǎn)生機(jī)械損傷，因而可以有效延長蔬菜等食品的保鮮期[3]，超聲波技術(shù)更多地在物理、化工等方面得到利用，但在水果保鮮方面應(yīng)用還較少。

高翔等[4]將西洋芹用超聲波處理后再用0.40%氯化鈣處理，結(jié)果表明除菌率達(dá)到80%，抑制了呼吸作用，對VC沒有明顯破壞作用，也沒有造成機(jī)械損傷，有助于西洋芹的保鮮。

溶菌酶又稱N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶或胞壁質(zhì)酶，是一種專門作用于某種目的微生物細(xì)胞壁的糖苷水解酶，主要破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1, 4糖苷鍵，從而使細(xì)胞壁中的不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物溢出而使細(xì)菌溶解[5]。因為人和動物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，不存在肽聚糖結(jié)構(gòu)，因而溶菌酶對人體細(xì)胞沒有毒性。

溶菌酶及復(fù)合涂膜保鮮劑在果蔬中的保鮮也有一定研究應(yīng)用。胡曉亮等[6]以海藻酸鈉和溶菌酶為保鮮劑對馬陸葡萄進(jìn)行復(fù)合涂膜保鮮，結(jié)果表明，1%海藻酸鈉和0.1%溶菌酶處理后的馬陸葡萄，感官效果最好。

邱朝坤等[7]采用不同濃度溶菌酶、殼聚糖和氯化鈣復(fù)合保鮮液對草莓進(jìn)行保鮮，結(jié)果表明0.05%溶菌酶的復(fù)合保鮮液對草莓的保鮮效果最好，失重率降低，較好地保持其風(fēng)味品質(zhì)。

通過研究不同超聲波溫度、超聲波功率、超聲波處理時間、溶菌酶濃度、溶菌酶作用時間對鮮切蘋果VC和還原糖[8]的影響，從而找到實現(xiàn)蘋果VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大、還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的最適條件，實現(xiàn)對蘋果的防腐保鮮作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗原料

市售同品種蘋果。

1.1.2 主要材料

50 mL燒杯；量筒；堿式滴定管；錐形瓶；比色皿；保鮮膜。

1.1.3 主要試劑

氯化鈣（分析純，天津博迪化工股份有限公司）；抗壞血酸（分析純，洛陽市化學(xué)試劑廠）；草酸（化學(xué)純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；2, 6-二氯酚靛酚鈉（分析純，鄭州派尼化學(xué)試劑廠）。

1.1.4 主要試驗儀器與設(shè)備

HWS28電熱恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市英峪華科儀器廠）；九陽JYL-C012料理機(jī)（九陽股份有限公司）；冰箱（合肥美菱股份有限公司）；T6新世紀(jì)紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 方法

1.2.1 研究方法

選擇新鮮的蘋果，洗凈、去皮，切成3 g蘋果片，置于50 mL燒杯中，加入溶菌酶溶液，保鮮膜封口。設(shè)置超聲波溫度、功率、時間，進(jìn)行處理。反應(yīng)結(jié)束后，吹干蘋果片放入4 ℃冰箱中保存，4 d后，測定VC和還原糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.2 VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)液的滴定

準(zhǔn)確吸取1 mL配制的標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液，加9 mL 1%草酸，用2, 6-二氯酚靛酚鈉溶液進(jìn)行滴定至淡紅色，并保持15 s不褪色，即達(dá)終點。由所用2, 6-二氯酚靛酚鈉的體積計算出1 mL 2, 6-二氯酚靛酚鈉相當(dāng)于多少毫克抗壞血酸（取10 mL 1%草酸作空白對照，按以上方法滴定）。

1.2.2.2 樣品液的滴定

將超聲波處理后的蘋果片從冰箱中取出，粉碎后置于50 mL燒杯中，真空抽濾，定容至50 mL，從中取10 mL進(jìn)行滴定（方法同1.2.2.1）；同時取10 mL 1%草酸溶液作空白對照滴定，記錄數(shù)據(jù)。計算如式（1）（2）所示。

式中：V1為滴定樣品提取液所用2, 6-二氯酚靛酚鈉溶液體積，mL；V2為滴定空白對照所用2, 6-二氯酚靛酚鈉溶液體積，mL；V3為樣品提取液總體積，mL；D為滴定時所取樣品提取液體積，mL；m為待測樣品質(zhì)量，g；T為1 mL 2, 6-二氯酚靛酚鈉相當(dāng)于抗壞血酸的毫克數(shù)。

1.2.3 蘋果中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[9]

（1）稱取適量葡萄糖粉末，在75 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重。稱取100 mg干燥好的葡萄糖，加少量蒸餾水溶解并定容至100 mL，即配制成1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（2）按表1取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加蒸餾水稀釋至2 mL，然后加入2 mL DNS試劑，充分混勻。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

（3）將（2）中各試管放在沸水浴中煮沸5 min，然后取出冷卻至室溫。

（4）利用紫外可見光分光光度計，于波長540 nm測定各溶液的吸光度，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計算

從1.2.2.2中的樣品液中取出1 mL，稀釋至10 mL。取出1 mL稀釋液，加入1 mL蒸餾水和2 mL DNS試劑，混合均勻后沸水浴加熱5 min，冷卻至室溫，在540 nm處測定吸光度，根據(jù)式（3）計算還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

還原糖=x×V×n/（m×103×V*） （3）式中：x為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的還原糖質(zhì)量，mg；n為稀釋倍數(shù)；V為樣品液總體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；V*為檢測時取用樣品液體積，mL。

1.3 單因素試驗

1.3.1 不同超聲波溫度對蘋果VC和還原糖的影響

取3 g洗凈去皮切片的蘋果，加入20 mL 0.15%溶菌酶液，設(shè)置超聲波溫度40 ℃、時間15 min、功率160 W，反應(yīng)結(jié)束后取出，吹干，放入4 ℃冰箱保存。4 d后將蘋果片從冰箱中取出，測定VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

依次將超聲波溫度改為25，30，35和45 ℃，重復(fù)上述試驗。

1.3.2 不同超聲波功率對蘋果VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

將超聲波功率設(shè)定為120，140，160，180和200 W，超聲波溫度40 ℃、時間15 min，重復(fù)1.3.1的操作。

1.3.3 不同超聲波處理時間對蘋果VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

將超聲波時間改為10，15，20和25 min，設(shè)置超聲波溫度40 ℃、功率160 W，重復(fù)1.3.1的操作。

1.3.4 不同溶菌酶濃度對蘋果VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

將溶菌酶濃度改為0.05%，0.10%，0.15%，0.20%和0.25%，設(shè)置超聲波溫度40 ℃、時間15 min、功率160 W，重復(fù)1.3.1的操作。

1.3.5 不同溶菌酶作用時間對蘋果VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

將溶菌酶作用時間設(shè)置為2，4，6，8和10 d，設(shè)置超聲波溫度40 ℃、時間15 min、功率160 W，重復(fù)1.3.1的操作。

1.4 正交試驗

根據(jù)5個因素的試驗結(jié)果，設(shè)計正交試驗，探索超聲波結(jié)合溶菌酶對蘋果保鮮效果的優(yōu)化條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3.4065x-0.0927（R2= 0.9948）。其中，x表示葡萄糖質(zhì)量，mg；y表示吸光度。

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1 超聲波溫度對鮮切蘋果保鮮效果的影響

超聲波溫度對鮮切蘋果保鮮效果的影響見圖1和圖2。

由圖1和圖2可以看出，VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增加后減少，溫度35 ℃時，VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值，分別為2.05 mg/100 g和4.794%，隨后VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨溫度升高而下降。

圖1 超聲波溫度對鮮切蘋果保鮮VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖2 超聲波溫度對鮮切蘋果還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

在一定溫度范圍內(nèi)，隨著超聲波作用溫度升高，超聲波作用的滅菌效應(yīng)增強(qiáng)，同時，隨著溫度升高，溶菌酶的滅菌效果逐漸強(qiáng)化，兩方面的共同作用使得蘋果的保鮮效果達(dá)到最佳；隨著溫度持續(xù)升高，酶變性、失活，滅菌效果弱化，底物的消耗增加，同時溫度升高對還原糖和VC具有破壞作用，綜合作用使得兩者的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降。

2.2.2 超聲波功率對鮮切蘋果保鮮效果的影響

超聲波功率對鮮切蘋果保鮮效果的影響見圖3和圖4。

由圖3可以看出，超聲波功率120～160 W時，VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加，超聲波功率160 W時，VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高，1.46 mg/100 g，隨后VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降。

圖3 超聲波功率對鮮切蘋果VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖4可以看出，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著超聲波功率增加呈現(xiàn)出先升高后降低趨勢，160 W時還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。

圖4 超聲波功率對鮮切蘋果還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

超聲波的熱效應(yīng)、空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)使得滅菌效果隨功率的增加而增強(qiáng)；功率超過一定值時，熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)使得酶的活性逐漸被破壞，而還原糖和VC也被破壞，因此VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在160 W后呈下降趨勢。高功率也會增加能量的損耗，對于一定質(zhì)量的原料來說，過高的功率會造成“空超”現(xiàn)象，因此最佳超聲波功率設(shè)定為160 W。

2.2.3 超聲波處理時間對鮮切蘋果保鮮效果的影響

超聲波處理時間對鮮切蘋果保鮮效果的影響見圖5和圖6。

由圖5可以看出，隨著超聲波處理時間延長，VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先增加后減少趨勢，并在10 min時VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最高峰。

圖5 超聲波處理時間對鮮切蘋果VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖6可以看出，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先增加后減少趨勢，處理時間10 min時，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。

圖6 超聲波處理時間對鮮切蘋果還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

在一定時間范圍內(nèi)，超聲波和溶菌酶作用的效果隨時間延長而強(qiáng)化，滅菌效果顯著，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加直至最大；然而，原料長時間暴露在超聲波中，熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)會使溶菌酶變性失活、還原糖和VC被破壞，導(dǎo)致10 min后VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降。

2.2.4 溶菌酶濃度對鮮切蘋果保鮮效果的影響

溶菌酶濃度對鮮切蘋果保鮮效果的影響見圖7和圖8。

由圖7可以看出，隨著溶菌酶濃度升高，作用效果增強(qiáng)，溶菌酶濃度0.15%時，VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加最快，繼續(xù)增加溶菌酶濃度對蘋果保鮮沒有顯著影響。

圖7 溶菌酶濃度對鮮切蘋果保鮮VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖8可以看出，隨著溶菌酶濃度增加，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增加后趨于穩(wěn)定，溶菌酶濃度小于0.15%時，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增幅較大；溶菌酶濃度大于0.15%時，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著變化。

溶菌酶的作用主要體現(xiàn)在通過降解微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)實現(xiàn)滅菌的目的，減少營養(yǎng)成分的損耗，達(dá)到保鮮的目的。在反應(yīng)體系中，1, 4-糖苷鍵構(gòu)成的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)是作用的底物，酶是催化劑。隨著溶菌酶濃度的增加，作用效果增強(qiáng)，表現(xiàn)為還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，直至最大；而后溶菌酶濃度的增加對于限定的底物來說，不會提升反應(yīng)速率，VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)趨于穩(wěn)定。

2.2.5 溶菌酶作用時間對鮮切蘋果保鮮效果的影響

溶菌酶作用時間對鮮切蘋果保鮮效果的影響見圖9和圖10。

圖9 溶菌酶作用時間對鮮切蘋果VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖10 溶菌酶作用時間對鮮切蘋果還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖9可以看出，VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著時間延長呈下降趨勢，第2～第4天下降趨勢最為緩慢，隨后VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少幅度增加。

反應(yīng)起始，溶菌酶活性較強(qiáng)，高效地降解細(xì)胞壁，營養(yǎng)物質(zhì)的保存率較高，隨著保存時間的延長，低溫下溶菌酶活性逐漸減弱，同等條件下，其作用效果降低，營養(yǎng)基質(zhì)的降解速率加快，VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降迅速。溶菌酶作用時間4 d較為適宜。

2.3 正交試驗

在超聲波溫度35 ℃、超聲波功率160 W、超聲波處理時間10 min、溶菌酶濃度0.15%、溶菌酶作用時間4 d條件下，利用正交軟件設(shè)計正交試驗，因素水平表和試驗安排見表1～表3。

表1 正交試驗設(shè)計的因素及水平

2.4 正交試驗結(jié)果及分析

由表2和表3數(shù)據(jù)可知，超聲波功率和溶菌酶作用時間是影響試驗結(jié)果的主要因素。因此在實際操作中對這兩個因素應(yīng)嚴(yán)格要求。

表3 正交試驗設(shè)計表（還原糖）

由正交試驗的直觀分析可得，最佳處理條件是A2B3C4D1E2，即超聲波溫度30 ℃、超聲波功率160 W、超聲波處理時間20 min、溶菌酶濃度0.05%、溶菌酶作用時間4 d時，蘋果VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高可達(dá)2.04 mg/100 g，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為4.294%。

表2和表3中R值的分析結(jié)果顯示，以VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，A2B3C2D3E2為最佳的工藝條件；以還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，最優(yōu)的工藝條件為A3B3C1D1E2。

驗證試驗結(jié)果顯示，A2B3C2D3E2時的VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2.08 mg/100 g）和A3B3C1D1E2條件下的還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（4.312%）略高于A2B3C4D1E2時的結(jié)果，結(jié)果差別不顯著，實際中可選擇A2B3C4D1E2作為最優(yōu)工藝。

3 結(jié)論

利用超聲波結(jié)合溶菌酶對鮮切蘋果進(jìn)行保鮮的研究，主要分析了超聲波溫度、超聲波功率、超聲波處理時間、溶菌酶濃度、溶菌酶作用時間對鮮切蘋果保鮮的影響，優(yōu)化工藝條件為超聲波溫度30 ℃、超聲波功率160 W、超聲波處理時間20 min、溶菌酶濃度0.05%、溶菌酶作用時間4 d，蘋果的VC和還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為2.04 mg/100 g和4.294%。