李誠至，張慶，林鈺涓，于曉章

桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院（桂林 541006）

在植物性食品中，水稻富含各種氨基酸，氨基酸精確含量涉及水稻的品質(zhì)、口感、營養(yǎng)含量等，因此測定水稻中的氨基酸含量顯得至關(guān)重要[1-6]。傳統(tǒng)的植物組織中氨基酸分析，一般采用柱前衍生液相色譜法處理[7-11]。為此，人們研究了各種類型的衍生劑，由于基質(zhì)不一樣，大部分衍生劑不能通用。而且衍生劑還存在價格昂貴，衍生效果差，容易損害色譜柱等缺陷[12-14]。另外，水稻中富含纖維素、蛋白質(zhì)、有機酸、次生代謝產(chǎn)物等成分，這些化合物均干擾氨基酸的檢測[15-16]。

實際樣品分析中，我們發(fā)現(xiàn)有些氨基酸不穩(wěn)定，特別是涉及抗逆功能的氨基酸極易被氧化還原，易造成分析結(jié)果的假陽性[6-7,17,19]。并且這些分析方法檢測氨基酸數(shù)量偏少，衍生劑普適性較差或者價格昂貴，難以滿足現(xiàn)實的需求。將HPLC的高效分離與串聯(lián)質(zhì)譜MRM鑒定相結(jié)合，在分析復(fù)雜樣品時可以獲得較高的選擇性和靈敏度?；诠滔噍腿?高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水稻中氨基酸的研究也鮮見報道。此次試驗建立了固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（SPE-HPLC-MS/MS）法測定水稻中的10種氨基酸，為水稻中氨基酸含量分析提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甲酸，F(xiàn)luka；乙腈、甲醇，Merck；甲酸銨、所有氨基酸及其衍生物的標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma-Aldrich。試驗用水均為Mili-Q Plus去離子水。

Agilent 1290 Infinity高液相色譜儀串聯(lián) LC-5500 QTrap質(zhì)譜儀（AB SCIEX）；渦旋混勻儀（美國MET VXT-200）；低溫高速離心機（Eppendorf 5430R）；色譜柱Zic-HILIC（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取0.10 mg的異亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用0.1%的HCl溶解并定容至100 mL，即配制成1.0 mg·L-1的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品前處理

水稻由桂林市農(nóng)業(yè)研究所提供。選取一定量的水稻，經(jīng)過液氮冷凍處理，研磨后準(zhǔn)確稱取，每份樣品50 mg。每份樣本中，先加入1 mL甲醇-乙腈-水溶液（2∶2∶1，V/V），渦旋混合均勻，低溫超聲30 min，在-20 ℃條件下孵育1 h沉淀蛋白，使用離心機在14000 r/min條件下離心20 min，取上清液。

固相萃?。河?.00 mL甲醇活化Waters Oasis Prime HLB小柱（Waters公司，USA）；提取液過柱，用4.00 mL乙腈-水溶液（50∶50，V/V）淋洗。收集洗脫液，氮吹近干。在進(jìn)入質(zhì)譜檢測分析時，加入100 μL乙腈-水溶液（1∶1，V/V）復(fù)溶，使用離心機在14000 r/min條件下離心20 min，然后進(jìn)樣分析。

1.2.3 色譜條件

流動相：A液為25 mmol·L-1甲酸銨和0.08%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸-乙腈溶液。將樣品置于4 ℃自動進(jìn)樣器中，柱溫為40 ℃，流速為0.25 mL·min-1，進(jìn)樣量為2 μL。梯度洗脫程序設(shè)置：0～12 min，B液從90%線性變化至70%，A液相應(yīng)地從10%線性變化至30%；12～18 min，B液從70%線性變化至50%，A液相應(yīng)地從30%線性變化至50%；18～25 min，B液從50%線性變化至40%，A液相應(yīng)地從50%線性變化至60%；25～30.1 min，B液從40%線性變化至90%，A液相應(yīng)地從60%線性變化至10%；30.1～37 min，B液維持在90%，A液維持在10%。

1.2.4 質(zhì)譜條件

采用5500 QTrap質(zhì)譜儀（AB SCIEX）在正離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析。采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；5500 QTrap ESI源條件：離子源溫度500 ℃；離子源氣體1（Gas1）40；離子源氣體2（Gas2）40；簾氣（CUR）30；噴霧電壓（ISVF）5500 V；采用MRM模式檢測待測離子對。

1.3 統(tǒng)計分析

采用IBM SPSS 18.0和Microsoft office Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

氨基酸的檢測有采用正離子模式，也有采用負(fù)離子模式[13-14,17]。在負(fù)離子模式[ESI（-）]下，部分氨基酸產(chǎn)生了[M+COOH]-、[M+Cl]-的準(zhǔn)分子離子峰。[M+Cl]-可能來源于水中氯離子影響，[M+COOH]-則是由于流動相中甲酸引起的。在正離子模式[ESI（+）]下，10種氨基酸均產(chǎn)生了較強的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，部分化合物也存在較弱的[M+Na]+加合峰。為提高方法靈敏度，試驗選擇正離子模式[ESI（+）]，以[M+H]+作為母離子，進(jìn)行質(zhì)譜其他參數(shù)的優(yōu)化。再對母離子和子離子的裂解電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，以2個豐度最高的特征離子分別作為定量離子和定性離子，并對電噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、去簇電壓及碰撞電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定出最佳的質(zhì)譜參數(shù)。所有氨基酸的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 10種氨基酸的保留時間和質(zhì)譜分析參數(shù)

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

試驗選擇了Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse AAA色譜柱（75 mm×4.6 mm，3.5 μm）和Zic-HILIC柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）進(jìn)行考察。在二元流動相甲酸銨-甲酸水溶液-乙腈流動相下，對10種氨基酸分離條件進(jìn)行了優(yōu)化。由于很多氨基酸的水溶性較好，在C18柱和Eclipse AAA柱上的分離效果較差，其峰拖尾嚴(yán)重，不適合選用。鑒于此，最終選擇Zic-HILIC柱為色譜柱，并且在此基礎(chǔ)上，采用二元流動相進(jìn)行梯度洗脫優(yōu)化。

2.2.2 流動相的選擇

考察10種氨基酸在乙腈（0.1%甲酸）和水（0.1%甲酸）等流動相中的分離情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正離子模式下，甲酸有利于促進(jìn)分析物的質(zhì)子化，增強目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)信號。因此，選擇25 mmol·L-1甲酸銨和0.08%甲酸水溶液為流動相A液，選擇0.1%甲酸-乙腈溶液為流動相B液。

鑒于上述化合物含有相同母核結(jié)構(gòu)且極性差異較小，故考察幾種梯度洗脫程序?qū)ιV分離的影響：（1）0 min，75% B；12 min，55% B；18 min，35% B；25 min，25% B；30.1 min，75% B；37 min，90% B；（2）0 min，80% B；12 min，60% B；18 min，40% B；25 min，30% B；30.1 min，70% B；37 min，90% B；（3）0 min，85% B；12 min，65% B；18 min，45% B；25 min，35% B；30.1 min，85% B；37 min，90% B；（5）0 min，90% B；12 min，70% B；18 min，50% B；25 min，40% B；30.1 min，90% B；37 min，90% B。最終確定梯度洗脫方案（5），大部分物質(zhì)能在25 min內(nèi)基本實現(xiàn)基線分離，且該分離條件用到揮發(fā)性的甲酸和甲酸銨改性劑，非常適合于質(zhì)譜檢測。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用0.1%鹽酸水溶液稀釋配制成0.002，0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00和2.00 μg·kg-1標(biāo)準(zhǔn)工作液系列。按照已經(jīng)優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件，對標(biāo)準(zhǔn)工作液系列進(jìn)行分析。如表2所示，10種氨基酸線性范圍均在2.00×10-3～2.00 μg·kg-1之間，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.9980，賴氨酸的檢出限最低至1.00×10-4μg·kg-1。

表2 10種氨基酸的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.4 前處理方式的選擇

水稻中的異亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸，不同的提取方式對試驗結(jié)果有很大影響。以氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液為試驗對象，選擇了2種不同的方式。方式1：以10%乙醇作為提取劑，提取后離心，上清液上機檢測；方式2：樣品經(jīng)固相萃取柱凈化，經(jīng)過洗脫后上機檢測。試驗結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，經(jīng)Waters Oasis Prime HLB固相萃取柱處理過的樣品液中干擾物明顯減少。這是由于SPE小柱中的材料對水稻中雜質(zhì)有吸附作用，截留樣品中的雜質(zhì)，對試驗的準(zhǔn)確性和精確性有很大的提高；而以體積分?jǐn)?shù)為10%乙醇沉淀水稻中的蛋白質(zhì)，很難將樣品中的干擾物清除完全。因此，選擇Waters Oasis Prime HLB處理為前處理方式。

圖1 10種標(biāo)準(zhǔn)混合氨基酸的MRM色譜圖

2.5 固相萃取的優(yōu)化

2.5.1 洗脫液的選擇

依據(jù)上述試驗結(jié)果，選用Waters Oasis Prime HLB固相萃取小柱對水稻中10種氨基酸進(jìn)行凈化和富集。在對小柱的洗脫液方面，分別比較了體積分?jǐn)?shù)為0，25%，50%，75%和100%的乙腈溶液的洗脫效果，結(jié)果以10種氨基酸的平均回收率為比較依據(jù)，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為50%時，10種氨基酸平均回收率比較高，此時體積分?jǐn)?shù)為50%乙腈的溶液洗脫能力較強，能較完全地洗脫氨基酸，所以試驗選擇體積分?jǐn)?shù)為50%的乙腈溶液作為樣品的洗脫液。

圖2 洗脫液對10種氨基酸平均回收率的影響

2.5.2 洗脫液體積的選擇

在上述選用50%乙腈-水溶液作為Waters Oasis Prime HLB固相萃取柱洗脫液的基礎(chǔ)上，比較了洗脫液體積對10種氨基酸平均回收率的影響。試驗考察1，2，3，4和5 mL這5個體積對氨基酸洗脫效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，隨著洗脫液體積不斷增加，10種氨基酸平均回收率逐漸增加，但洗脫液體積達(dá)到4 mL以后再增加洗脫劑體積，回收率并沒有明顯增加，此時Waters Oasis Prime HLB固相萃取小柱中的氨基酸較完全地被洗脫出，再增加洗脫液體積，其對氨基酸回收率影響不大，所以選擇4 mL為洗脫體積較合適。

圖3 洗脫液體積對10種氨基酸平均回收率的影響

2.6 回收率和精密度

在處理過的水稻樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合溶液，配制成0.01，0.20和2.00 μg·kg-13個濃度加標(biāo)水平的樣品，每個濃度設(shè)6個平行樣。用上述色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法進(jìn)行測定，平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）見表3。從表3可以看出，加標(biāo)回收率在82.0%～118.2%之間，SRSD在3.2%～8.7%之間。

表3 10種氨基酸的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差試驗結(jié)果（n=6）

2.7 實際樣品分析

用該方法分別對湘早秈45號、秈優(yōu)63號、桂朝2號這3個品種水稻進(jìn)行分析，每個樣品平行測定2次，測試結(jié)果具體見表4。從表4可以看出，除了谷氨酰胺在樣品中未檢出外，絕大部分樣品濃度范圍在0.908～ 9.970 μg·kg-1之間，其中脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸和賴氨酸含量比較高；湘早秈45號水稻葉部樣品總離子流圖見圖4。

表4 水稻中10種氨基酸含量

圖4 水稻中氨基酸分析總離子流圖（湘早秈45號）

2.8 方法對比分析

將該方法所得的結(jié)果與GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》檢出限進(jìn)行對比，結(jié)果如表5所示。從表5可以看出，此次研究建立的多種氨基酸測定方法的檢出限比大部分文獻(xiàn)中所報道的檢測方法檢出限低。另外，國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定固體取樣量為2 g，該方法取樣量為50 mg，相對取樣量更小。

表5 氨基酸測定方法的檢出限對比

3 結(jié)論

此次試驗采用固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水稻中的10種氨基酸（異亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸），可在25 min內(nèi)實現(xiàn)基線分離，較傳統(tǒng)的衍生-液相色譜法和氨基酸自動分析法極大縮短耗時[16-18]，氨基酸的檢測效率得到明顯提高，檢出限在1.00×10-4～6.40×10-4μg kg-1之間；加標(biāo)回收率在82.0%～118.2%之間，SRSD在3.2%～8.7%之間。此外，該方法樣品前處理簡單，不需要添加衍生劑，可以避免由衍生化處理帶來的誤差，并且極大地縮短了分析時間，使得大樣本量分析更容易。將建立的方法用于湘早秈45號等3種水稻的氨基酸分析，成功地檢測到9種氨基酸。