高玉梅，柳毅，李洪，尹斯雅

1. 河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院（邯鄲 056002）；2. 保定市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所（保定 071051）；3. 河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院（石家莊 050026）

馬科動(dòng)物驢（Equus asinusL.）的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠為阿膠（Asini coriiColla）[1]，具有滋陰潤燥、補(bǔ)血止血的功效，是傳統(tǒng)的補(bǔ)藥。因其食藥同源，常作為功效原料被廣泛添加到保健食品中。阿膠類保健食品因其形式多、構(gòu)成成分復(fù)雜，在保健食品市場占據(jù)舉足輕重的地位[2-4]。近些年由于驢養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展滯后，驢皮供應(yīng)量呈逐年下滑之勢，原料價(jià)格大幅上升，不法商販?zhǔn)芾娴尿?qū)使，在阿膠藥材及其保健制品中摻入馬皮、豬皮、牛皮、騾皮及羊板皮等偽皮膠充數(shù)添加到阿膠及其保健食品中[5]。由于馬和驢是同屬同科，騾又為驢與馬的雜交品種。騾皮、馬皮與驢皮在色澤、性狀等方面十分近似難以區(qū)分，因此市場上以騾皮、馬皮等作為偽皮制造阿膠較為常見，這嚴(yán)重打擊了消費(fèi)者的信心和合法商家的權(quán)益[6-7]。

阿膠及其保健食品中動(dòng)物源成分的檢測方法目前多將馬源性成分作為檢測目標(biāo)，利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和實(shí)時(shí)熒光PCR法進(jìn)行分析[8-11]。但這兩種方法檢測成本高，樣品的前處理時(shí)間較長，都需要昂貴儀器，且需要專業(yè)的技術(shù)人員，不利于基層推廣。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)反應(yīng)結(jié)果可直接通過肉眼進(jìn)行觀察，省去了繁瑣的電泳過程[12]。所用設(shè)備簡單、成本低，可滿足快速檢測的需要，具有廣泛的應(yīng)用前景[13]。試驗(yàn)以馬的線粒體ATPase6基因作為靶基因并設(shè)計(jì)引物[14]。利用LAMP擴(kuò)增技術(shù)原理建立可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測阿膠及其保健食品中馬源性成分的方法，并評估此方法的特異性、靈敏度和符合率，為保障阿膠及其保健食品的品質(zhì)和市場監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用自制阿膠樣品及其保健食品：市場購買6種驢皮、馬皮、馬騾皮、牛皮、羊皮、豬皮，委托阿膠生產(chǎn)企業(yè)按生產(chǎn)工藝制作膠類產(chǎn)品及其保健食品，共5種劑型（阿膠片、阿膠粉、阿膠糕、阿膠口服液、阿膠含片）。

阿膠標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（中國食品藥品檢定研究院，批號121274-201703）；馬肉、驢肉、馬騾肉、羊肉、牛肉、豬肉、狗肉、狐貍?cè)狻⒙谷?、雞肉、兔肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、魚肉、蝦肉、鼠肉、駱駝肉（石家莊海關(guān)技術(shù)中心）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀（德國Biometra公司）；UVIPro凝膠成像儀（英國UVItec華粵企業(yè)有限公司）；Nanodrop 2000分光光度計(jì)（美國Thermo scientific公司）；CFX96 Touch實(shí)時(shí)熒光PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.1.3 主要試劑

脫氧核糖核苷酸（dNTPs）、100 bp DNA Ladder Marker、10×Buffer、MgSO4、Bst DNA聚合酶（Large fragment）、Alu I限制性內(nèi)切酶、SYBR Green I熒光染料（大連寶生物有限公司）；LAMP引物、實(shí)時(shí)熒光定量PCR探針及引物（北京華大基因合成）；DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒（北京華大生物有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物基因組DNA的提取

按試劑盒提取法提取供試動(dòng)物基因組DNA，作為體系模板。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取馬的線粒體ATPase6基因作為靶基因。根據(jù)Genebank中公布的馬的線粒體ATPase6基因序列進(jìn)行BLAST同源性分析，使用DNAMAN和Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，具體的引物信息見表1。

表1 馬的線粒體ATPase 6基因

1.2.3 LAMP 反應(yīng)體系

經(jīng)過優(yōu)化，建立最佳的LAMP擴(kuò)增體系：內(nèi)引物FIP和BIP（5 μmol/L）各2 μL，外引物F3和B3（5 μmol/L）各1 μL，4 μL dNTPs（2 mmol/L each），2.5 μL 10×Bst DNA reaction buffer，2 μL MgSO4（25 mmol/L），1 μL Bst DNA 聚合酶（8000 U/mL），1.0 μL模板DNA，用去離子水補(bǔ)足體系至20 μL。添加所需試劑后，離心管放入水浴鍋中，于62 ℃反應(yīng)70 min，并于80 ℃保持5 min，終止反應(yīng)。

1.2.4 LAMP引物特異性分析

選取18種樣品進(jìn)行引物特異性分析，樣品經(jīng)過處理，分別提取模板后，按照優(yōu)化好的LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)。向LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1 μL熒光染料SYBR Green I，肉眼觀察顏色變化。陽性結(jié)果為綠色，陰性結(jié)果顯示為橙色。

1.2.5 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物酶切分析

選取清晰的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，依照試劑盒Alu I試驗(yàn)說明，按總體積30 μL的體系進(jìn)行酶切鑒定，在65 ℃條件下反應(yīng)1 h，通過凝膠電泳法觀察酶切產(chǎn)物。

1.2.6 LAMP靈敏度分析

對馬肉進(jìn)行模板DNA提取，使用無菌去離子水逐次進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，其模板濃度分別為10～0.00001 ng/μL，取1 μL模板DNA，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，產(chǎn)物通過熒光可視法分析，確定其靈敏度，且對該試驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。并以行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3730.5—2013實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測方法為對照，評估LAMP方法的靈敏度。

1.2.7 阿膠及其保健食品中馬源性成分測定

通過優(yōu)化好的LAMP方法對5種劑型的60個(gè)自制膠類及其保健食品樣品進(jìn)行馬源性成分測定，樣品信息見表2，評估LAMP方法的準(zhǔn)確性。

表2 自制膠類及其保健食品樣品 單位：個(gè)

1.2.8 LAMP實(shí)際應(yīng)用與評估

為驗(yàn)證LAMP方法對阿膠及其保健食品中馬源性成分的檢出情況，對市售50種樣品進(jìn)行檢測，得到LAMP和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3730.5—2013實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測數(shù)據(jù)。采用敏感性、特異性及符合率3個(gè)指標(biāo)評價(jià)LAMP方法。按式（1）～（3）計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP特異性分析

LAMP反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入1 μL SYBR Green I熒光染料。結(jié)果如圖1所示，陽性結(jié)果顯示綠色（圖示為無色），陰性對照顯示橙色（圖示為黑色）。離心管1和2是含有馬源性成分的馬肉和馬騾肉，顯示綠色熒光（圖示為無色），離心管3～18是不含馬源性成分的肉樣，均顯示橙色（圖示為黑色）。由此可知，該引物具有良好的特異性。

圖1 LAMP反應(yīng)的特異性檢測結(jié)果

2.2 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切結(jié)果

限制性內(nèi)切酶Alu I的酶切位點(diǎn)為AG/CT，該識別位點(diǎn)位于引物F1c上，通過理論計(jì)算可知，其酶切產(chǎn)物主要是由97 bp和60 bp的DNA片段組成。由圖2可知，由于60 bp的DNA片段較短，所以在凝膠電泳結(jié)果中條帶比較彌散，顯示不太明顯，而97 bp的DNA片段其凝膠電泳結(jié)果中條帶十分明顯。試驗(yàn)表明LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果正確。

圖2 LAMP產(chǎn)物酶切結(jié)果

2.3 LAMP靈敏度分析

馬肉模板梯度稀釋后，各取1 μL模板DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)，在反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)管中添加1 μL熒光染料SYBR Green I。反應(yīng)結(jié)果如圖3所示，陽性結(jié)果顯示熒光綠色（圖示為無色），陰性對照顯示橙色（圖示為黑色），日光下肉眼可辨別。當(dāng)模板濃度為10～0.0001 ng/μL時(shí)出現(xiàn)綠色熒光（圖示為無色），0.00001 ng/μL時(shí)出現(xiàn)橙色熒光（圖示為黑色），由此可知LAMP熒光可視法檢測馬源性成分的靈敏度是0.0001 ng/μL。

圖3 LAMP反應(yīng)的靈敏度檢測結(jié)果

按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3730.5—2013實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測方法進(jìn)行檢測，以滅菌的去離子水代替DNA模板，作為陰性對照。反應(yīng)結(jié)果如圖4所示，Ct值如表3所示。當(dāng)模板濃度為10～0.01 ng/μL時(shí)，均產(chǎn)生特異性擴(kuò)增曲線，且各模板濃度的平均Ct值均小于35；然而當(dāng)質(zhì)量濃度為0.001～0.00001 ng/μL時(shí)，未產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，且各模板濃度的平均Ct值均大于40。因此，實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏度是0.01 ng/μL。由此可知，LAMP法檢測的靈敏度為實(shí)時(shí)熒光PCR法的100倍。

表3 不同馬肉模板濃度的實(shí)時(shí)熒光PCR的Ct值

圖4 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏度

2.4 阿膠及其保健食品中馬源性成分測定

此次對5種劑型的60個(gè)自制膠類及其保健食品樣品進(jìn)行馬源性成分檢測，測定結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，只有以馬皮、馬騾皮為原料生產(chǎn)的產(chǎn)品中檢出馬源性成分，表明LAMP擴(kuò)增方法準(zhǔn)確性高。

表4 自制膠類及其保健食品樣品結(jié)果

2.5 實(shí)際樣品的檢測與 LAMP方法的評估

利用 LAMP和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3730.5—2013實(shí)時(shí)熒光PCR 2種方法檢測50種市售阿膠及其保健食品，結(jié)果如表5所示。

表5 LAMP方法評價(jià)

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了可視化LAMP檢測阿膠及其保健食品中馬源性成分的方法，通過肉眼觀察顏色判斷檢測結(jié)果，操作方便簡單。針對馬的線粒體ATPase6基因設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行特異性檢測。結(jié)果顯示，只有含馬源性成分的肉樣呈陽性，其他結(jié)果均顯示陰性，表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物具有較好的特異性。使用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3730.5—2013實(shí)時(shí)熒光PCR法和LAMP法對50種實(shí)際樣品進(jìn)行馬源性成分的檢測，并以SN/T 3730.5—2013法為參考對LAMP法進(jìn)行評估，其敏感性為100%，特異性為97.67%，符合率為98.00%。可視化LAMP方法具有操作方便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，將為阿膠及其保健食品的健康發(fā)展提供有利保障。