袁寶多，馬坤瑛，端肖楠，尹玉偉

1. 河南進(jìn)口肉類指定口岸漯河查驗(yàn)區(qū)服務(wù)中心（漯河 462000）；2. 漯河海關(guān)（漯河 462000）；3. 紅實(shí)農(nóng)場(chǎng)（項(xiàng)城 466236）

隨著生活水平的提高，人們對(duì)肉類品質(zhì)及安全性要求越來越高，在日常膳食結(jié)構(gòu)中，肉制品占很大比例，肉類的品質(zhì)與人們身體健康密切相關(guān)[1]。豬肉作為我國(guó)消費(fèi)者主要的肉食品之一，因極易腐敗變質(zhì)，對(duì)人們的健康具有一定的危害[2]。

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）作為評(píng)價(jià)肉品新鮮程度的重要指標(biāo)[3]，由于TVB-N測(cè)定操作方法較復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、滴定終點(diǎn)判定存在誤差，無法達(dá)到市場(chǎng)上肉品快速、大批量檢測(cè)的要求[4]。豬肉在腐敗過程中由于微生物和酶的作用產(chǎn)生大量的導(dǎo)電物質(zhì)，從而大大提高了導(dǎo)電性。目前，電導(dǎo)率法已被廣泛應(yīng)用于肉品的檢測(cè)[5]。同時(shí)，pH可以反映豬肉肌糖元酵解速度，其值的變化與肉的腐敗變質(zhì)有關(guān)[6]，影響其肉制品的品質(zhì)，因此，pH也是評(píng)價(jià)豬肉品質(zhì)的重要指標(biāo)[7]。過氧化物酶的活性水平是檢測(cè)肉質(zhì)的重要指標(biāo)之一，新鮮肉類中過氧化物酶活性較低，而變質(zhì)肉中的過氧化物酶活性相對(duì)較高[8]。

為了探索快速、簡(jiǎn)便的方法來確定肉的新鮮度，通過研究豬肉腐敗變質(zhì)過程中電導(dǎo)率、pH與豬肉TVB-N的變化規(guī)律以及探討電導(dǎo)率、pH與豬肉TVB-N之間的的相關(guān)性，為應(yīng)用電導(dǎo)率、pH快速評(píng)價(jià)豬肉的新鮮度提供理論依據(jù)。此外，以過氧化物酶含為指標(biāo)，研究3, 5, 3′, 5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和過氧化物酶的顯色反應(yīng)，為豬肉新鮮度快速檢測(cè)提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉：采購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)剛屠宰的新鮮健康豬肉。

硼酸、鹽酸及無水乙醇，北京化工廠；甲基紅-乙醇指示劑，天津市大茂化學(xué)試劑廠；次甲基藍(lán)指示劑，北京譜析科技有限公司；碳酸鈉、碳酸鉀，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸，河南拓源化工產(chǎn)品有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

主要使用的儀器設(shè)備，見表1。

表1 試驗(yàn)儀器設(shè)備一覽表

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 豬肉樣品

將從市場(chǎng)購(gòu)買的新鮮豬肉，存放于恒溫恒濕培養(yǎng)箱（溫度為25 ℃，濕度為80%），加速豬肉樣品的腐敗，每隔6 h取出所需樣品量，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.2 pH測(cè)定方法

準(zhǔn)確稱?。?0.00±0.01）g切碎的豬肉樣品，消除脂肪和結(jié)締組織，然后用勻漿機(jī)勻漿，加入100 mL蒸餾水，繼續(xù)勻漿，然后取濾液，用pH計(jì)測(cè)定豬肉濾液的pH。

1.3.3 電導(dǎo)率測(cè)定方法

準(zhǔn)確稱?。?0.00±0.01）g切碎的豬肉樣品，用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，然后加入100 mL蒸餾水，充分?jǐn)嚢杈鶆?。將電?dǎo)電極插入備好的試樣中，讀取精度為0.01 ms/cm[9]。

1.3.4 TVB-N測(cè)定方法

參照GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》對(duì)豬肉采用凱式定氮法測(cè)定樣品中TVB-N含量[10]。

1.3.5 試紙顯色法測(cè)定過氧化物酶的方法

準(zhǔn)確稱取（10.00±0.01）g切碎的豬肉樣品，將肉去除脂肪和結(jié)締組織，用勻漿機(jī)勻漿，加入100 mL的蒸餾水，繼續(xù)勻漿，然后過濾，濾液即為過氧化物酶原液。具體操作步驟參考王強(qiáng)等[11]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析和回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 新鮮豬肉電導(dǎo)率、pH和TVB-N變化規(guī)律結(jié)果與分析

2.1.1 新鮮豬肉電導(dǎo)率變化規(guī)律結(jié)果與分析

肉腐敗過程中微生物和酶的作用，導(dǎo)致肉中成分發(fā)生變化，尤其細(xì)胞中礦物質(zhì)鹽類等物質(zhì)會(huì)溶出，其中絕大多數(shù)物質(zhì)為導(dǎo)電性離子，如鈉、鉀、鈣離子等[12]。為了探究肉中導(dǎo)電性物質(zhì)的變化規(guī)律，對(duì)豬肉的電導(dǎo)率進(jìn)行測(cè)定。如圖1所示，新鮮肉在溫度25 ℃、濕度80%的條件下，恒溫恒濕加速腐敗，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，電導(dǎo)率整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中貯藏6 h時(shí)，電導(dǎo)率迅速上升，變化差異極顯著（p＜0.01）；在6～18 h時(shí)間段內(nèi)，電導(dǎo)率變化不顯著（p＞0.01），趨于平穩(wěn)；從24 h開始，電導(dǎo)率變化差異極顯著（p＜ 0.01），表明在這個(gè)時(shí)間段電導(dǎo)率極顯著地增加。

2.1.2 新鮮豬肉pH變化規(guī)律結(jié)果與分析

隨著時(shí)間的增加，豬肉的pH逐漸上升，且與肉的腐敗程度呈正相關(guān)。一般而言，pH在5.8～6.2時(shí)，為一級(jí)鮮肉；pH在6.3～6.6時(shí)，為二級(jí)鮮肉；pH＞6.6時(shí)，為腐敗肉。如圖2所示，新鮮豬肉在貯藏12 h時(shí)，pH呈波動(dòng)變化，豬肉在貯藏12 h之后，pH測(cè)定值變化比較顯著（p＜0.05），pH在42 h時(shí)達(dá)到6.7±0.10?？傮w來看，在48 h內(nèi)，豬肉pH逐漸增加，豬肉pH在貯藏前期出現(xiàn)波動(dòng)，這可能是由于肌肉中的肌糖原分解產(chǎn)生了酸性物質(zhì)（例如乳酸和磷酸），從而中和了豬肉表面細(xì)菌生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的堿性物質(zhì)。由于pH增加更有利于微生物的生長(zhǎng)，因此貯藏后期豬肉腐敗變質(zhì)更加明顯[13-14]。

圖2 豬肉的pH隨時(shí)間的變化關(guān)系

2.1.3 新鮮豬肉TVB-N值變化規(guī)律結(jié)果與分析

TVB-N值是評(píng)價(jià)豬肉新鮮度的最重要指標(biāo)之一[15]。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，TVB-N不斷增加，蛋白質(zhì)腐敗分解在脫氨基、脫羧后會(huì)形成大量的揮發(fā)性堿性含氮物質(zhì)，這將逐漸降低豬肉的新鮮度[16]。通常，新鮮肉TVB-N≤15 mg/100 g，次級(jí)鮮肉TVB-N含量≤25 mg/100 g，腐敗肉TVB-N＞25 mg/100 g[17]。如圖3所示，豬肉TVB-N在貯藏0～24 h時(shí)低于15 mg/100 g，表明樣品為一級(jí)新鮮；貯藏30～42 h時(shí)，TVB-N為15～25 mg/100 g，豬肉為中等新鮮；豬肉在貯藏42 h后，豬肉樣品腐敗變化明顯，已有腐臭氣味；當(dāng)貯藏48 h時(shí)，豬肉的TVB-N達(dá)到（38.29±0.97）mg/100 g。

圖3 豬肉的TVB-N值隨時(shí)間的變化關(guān)系

2.1.4 相關(guān)性分析

豬肉在貯藏期間，各個(gè)指標(biāo)之間的相關(guān)性分析見表2。從表2可以看出，TVB-N與電導(dǎo)率和pH呈正相關(guān)，且各個(gè)指標(biāo)之間呈現(xiàn)極顯著的相關(guān)性，可作為衡量豬肉新鮮程度的指標(biāo)。

表2 各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

2.1.5 電導(dǎo)率、pH與TVB-N值的回歸分析

如圖4所示，將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所測(cè)定的電導(dǎo)率和TVB-N值進(jìn)行回歸分析，以TVB-N（y，mg/100 g）為因變量，電導(dǎo)率（x，ms/cm）為自變量，得到擬合方程。電導(dǎo)率測(cè)定值和TVB-N值間相關(guān)關(guān)系檢驗(yàn)為極顯著（p＜0.01），得到的擬合回歸方程為y=38.549x- 36.098，決定系數(shù)R2=0.8121，電導(dǎo)率測(cè)定值和TVB-N值間呈直線回歸關(guān)系，即時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致豬肉的腐敗變質(zhì)，進(jìn)而使豬肉的電導(dǎo)率增加，TVB-N也逐漸增加。通過測(cè)定豬肉的電導(dǎo)率，利用此回歸數(shù)學(xué)模型，可計(jì)算出TVB-N，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)豬肉新鮮度的快速判定[18]。

圖4 電導(dǎo)率與TVB-N的相關(guān)性分析

如圖5所示，將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所測(cè)定的pH和TVB-N值進(jìn)行回歸分析，以TVB-N（y，mg/100 g）為因變量，pH（x，A）為自變量，得到擬合方程。pH測(cè)定值和TVB-N值間相關(guān)關(guān)系檢驗(yàn)為極顯著（p＜0.01），得到的擬合回歸方程為y=21.031x-117.96，決定系數(shù)R2=0.7964，pH測(cè)定值和TVB-N值間呈直線回歸關(guān)系，即時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致豬肉的腐敗變質(zhì)，進(jìn)而使豬肉的pH增加，TVB-N也逐漸增加。通過測(cè)定豬肉的pH，利用此回歸數(shù)學(xué)模型，可計(jì)算出TVB-N，將測(cè)得的pH依據(jù)GB 2707—2005鮮（凍）畜肉TVB-N指標(biāo)，判斷樣品的新鮮度[19]。

圖5 pH與TVB-N的相關(guān)性分析

2.2 聯(lián)苯胺顯色法對(duì)豬肉新鮮度的結(jié)果與分析

2.2.1 聯(lián)苯胺過氧化物酶顯色時(shí)間確定

如圖6所示，利用分光光度計(jì)在650 nm對(duì)其每20 s讀取一次數(shù)值，測(cè)定時(shí)間為3 min，顯色在0～60 s呈現(xiàn)較好的線性增加，60 s后增長(zhǎng)趨于平緩，因此確定60 s為聯(lián)苯胺顯色的最佳判讀時(shí)間，且60 s時(shí)的吸光度可以較好地反映過氧化物酶活性。

圖6 肉樣中過氧化物酶-聯(lián)苯胺顯色時(shí)間變化規(guī)律

2.2.2 貯藏過程變化過氧化物酶活性的變化規(guī)律

如圖7所示，在貯藏過程中用聯(lián)苯胺顯色法每隔一定時(shí)間對(duì)肉的過氧化物酶活性進(jìn)行測(cè)定，在貯藏過程中過氧化物酶活性從0～12 h降到最低，從18 h開始持續(xù)快速增長(zhǎng)。說明豬肉中的過氧化物酶活性隨肉的腐敗先逐漸降低，由于腐敗嚴(yán)重，增殖了大量腐敗菌，微生物中也含有大量過氧化物酶，因此隨著微生物數(shù)量不斷增加，豬肉中過氧化物酶活性逐漸升高，且遠(yuǎn)高于一開始新鮮豬肉的過氧化物酶活性[20]。因此，可根據(jù)豬肉中過氧化物酶活性變化規(guī)律，判斷豬肉的新鮮度。

圖7 豬肉貯藏過程中過氧化物酶活性變化規(guī)律

如圖8所示，將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)所測(cè)定的過氧化物酶吸光度和TVB-N值進(jìn)行回歸分析，以TVB-N（y，mg/100 g）為因變量，吸光度（x，B）為自變量，得到擬合方程：y=81.689x+8.2792，決定系數(shù)R2=0.933，吸光度和TVB-N值間呈直線回歸關(guān)系，即時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致豬肉的腐敗變質(zhì)，進(jìn)而使豬肉的過氧化物酶活性增加，TVB-N也逐漸增加。通過測(cè)定豬肉的過氧化物酶活性，利用此回歸數(shù)學(xué)模型，可計(jì)算出TVB-N，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)豬肉新鮮度的快速檢測(cè)。

圖8 吸光度與TVB-N值的相關(guān)性分析

2.2.3 聯(lián)苯胺過氧化物酶顯色反應(yīng)物濃度配比確定

通過對(duì)TMB乙醇溶液和H2O2水溶液利用試紙法進(jìn)行梯度搭配，對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)TMB（0.01%，0.02%，0.04%，0.06%，0.08%，0.1%，0.12%和0.14%）和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)H2O2（0.015%，0.02%，0.04%，0.06%，0.08%，0.1%，0.2%，0.4%，0.6%和1.0%）進(jìn)行單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，分別在揮發(fā)性鹽基氮為8和17 mg/100 g時(shí)進(jìn)行試紙法試驗(yàn)，加樣順序：TMB溶液、H2O2溶液、肉浸出液3種反應(yīng)物的添加量各1滴，加入肉浸出液后立即計(jì)時(shí)，記錄變色時(shí)間和現(xiàn)象。選出一級(jí)新鮮度時(shí)60 s內(nèi)不顯色，二級(jí)新鮮度時(shí)60 s內(nèi)就開始顯色的適宜濃度搭配。最終根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，確定最佳TMB與H2O2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為0.04%∶0.04%。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

進(jìn)一步對(duì)TMB與H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比0.04%∶0.04%進(jìn)行試紙法驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，結(jié)果證實(shí)TMB與H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比0.04%∶0.04%時(shí)具有較好的重復(fù)性，可應(yīng)用于豬肉新鮮度的檢測(cè)。

表3 最佳濃度驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

將新鮮豬肉在25 ℃、相對(duì)濕度80%的條件下貯藏，研究其貯藏期間電導(dǎo)率、pH和揮發(fā)性鹽基氮的變化，以及試紙顯色法測(cè)定過氧化物酶活性，快速檢測(cè)豬肉的新鮮度，對(duì)豬肉過氧化物酶活性水平進(jìn)行研究，通過過氧化物酶顯色識(shí)別豬肉新鮮程度的方法。結(jié)果表明：隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，TVB-N不斷增加，豬肉的電導(dǎo)率、pH也隨豬肉貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。通過相關(guān)性分析，電導(dǎo)率、pH和揮發(fā)性鹽基氮呈顯著相關(guān)，可以作為衡量豬肉新鮮程度的指標(biāo)。其中電導(dǎo)率測(cè)定值和TVB-N值間相關(guān)關(guān)系檢驗(yàn)為極顯著（p＜ 0.01），得到的擬合回歸方程為y=38.549x-36.098，決定系數(shù)R2=0.8121，電導(dǎo)率測(cè)定值和TVB-N值之間呈直線回歸關(guān)系；pH測(cè)定值和TVB-N值間得到的擬合回歸方程為y=21.031x-117.96，決定系數(shù)R2=0.7964，pH測(cè)定值和TVB-N值之間呈直線回歸關(guān)系，測(cè)定豬肉的電導(dǎo)率和pH，通過TVB-N與二者間的回歸關(guān)系方程，即可求出TVB-N，實(shí)現(xiàn)豬肉新鮮度的簡(jiǎn)便、快速判定。此外，過氧化物酶吸光度與TVB-N呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，制備的顯色紙對(duì)豬肉新鮮度有指示作用，其中TMB與H2O2的最佳配比為0.04%∶0.04%，進(jìn)而能夠方便地用于判斷市場(chǎng)上待售豬肉新鮮程度。目前，顯色法作為一種新型的檢測(cè)方法，對(duì)肉制品市場(chǎng)的無損檢測(cè)方法提供了一定的參考，新鮮度顯色法在豬肉保鮮和檢測(cè)方面具有較大的潛力。