楊鑫嬌，鄒迪，熊喆，張海珠，夏從龍，趙紅業(yè)

1 大理大學藥學院，云南大理671000；2 云南省動物基因編輯與體細胞克隆技術(shù)重點實驗室；3 云南省異種器官移植工程研究中心

乳腺癌是女性死亡的主要原因之一，2021年乳腺癌新診斷病例數(shù)占女性癌癥新診斷病例數(shù)的30%，由于腫瘤異質(zhì)性、治療耐藥、轉(zhuǎn)移和疾病復發(fā)，患者的治愈仍然面臨巨大挑戰(zhàn)［1-2］。乳腺癌根據(jù)腫瘤組織病理學檢查，可分為Luminal A 型、Luminal B型、HER-2 過表達型和三陰型［3］，其中三陰性乳腺癌占乳腺癌的10%～20%，其侵襲性強、遠處轉(zhuǎn)移率高、預后差，迄今治療僅限于非轉(zhuǎn)移性疾病的化療，并缺乏有效的治療方案［4］。自噬在乳腺癌活性方面發(fā)揮作用，并由自噬相關(guān)基因（ATG基因）調(diào)控，ATG基因是潛在的預后生物標志物和治療靶點［5］。在營養(yǎng)缺乏時，自噬使細胞內(nèi)溶酶體大量降解，消除受損的細胞器和蛋白質(zhì)聚集體并加以回收利用，這對腫瘤細胞存活至關(guān)重要［6-7］。ATG2 是一種定位于自噬前體液泡周圍的點狀蛋白，分為A、B 兩型，其中ATG2A 可以促進自噬體的延伸和閉合［8-11］。ATG9是自噬體形成核心機制中惟一的多次跨膜蛋白，在營養(yǎng)缺乏時，ATG9 以囊泡結(jié)合形式被運輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬起始部位，為自噬體形成提供膜源［12-13］。巴弗洛霉素A1（Baf-A1）是一種自噬抑制劑，通過阻止自噬體和溶酶體的融合從而抑制自噬［9］。2019年4月25日—2020年12月13日，本研究觀察了自噬誘導、抑制人三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-231 中ATG2A、ATG9A 表達變化，為開發(fā)新的乳腺癌治療策略、相關(guān)靶向藥物和臨床研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 人三陰性乳腺癌細胞系MDAMB-231 購于上海中科院細胞庫。DMEM 培養(yǎng)基、Earle's平衡鹽溶液（EBSS）購于美國Gibco公司，Baf-A1 購于上海生工生物工程有限公司，雙抗（青霉素-鏈霉素）購于Biological industries，胎牛血清購于Ex?Cell Bio 公司，抗-自噬相關(guān)蛋白LC3B 兔抗、抗P62/SQSTM1 兔抗和抗β-actin 鼠抗均購于美國Sigma 公司，抗ATG2A 兔抗購于美國CST 公司，抗ATG9A 兔抗購于英國Abcam 公司，TRIzol 購于TransGen Bio?tench 公司，Prime-Script RT 試劑盒、SYBR 酶購于美國Takara公司，BCA蛋白濃度檢測試劑盒、發(fā)光顯色液、蛋白提取試劑（RiPA Lysis Buffer）、蛋白Marker和Western blotting 一抗稀釋液均購于碧云天生物科技有限公司，血清蛋白購于北京索萊寶有限公司。

1.2 細胞自噬誘導、抑制處理及分組 乳腺癌MDA-MB-231細胞接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)于10 mL 含10%熱滅活胎牛血清、100 IU/mL 青霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h換液一次，待細胞長至培養(yǎng)皿80%左右進行細胞傳代，取對數(shù)生長期的細胞分別接種于10 cm 細胞培養(yǎng)皿，待細胞密度長至70%左右，將細胞分為4 組，對照組加入DMEM 培養(yǎng)液正常培養(yǎng)，Baf-A1組在DMEM培養(yǎng)液中加100 nmol/L的Baf-A1進行自噬阻斷，EBSS 組加入EBSS 培養(yǎng)液進行饑餓誘導，EBSS + Baf-A1 組在EBSS 培養(yǎng)液中加入100 nmol/L的Baf-A1，四組均處理4 h，備用。

1.3 各組細胞中ATG2A、ATG9A mRNA 檢測 采用實時熒光定量（Q-PCR）法。取各組細胞，TRIzol法提取總RNA，cDNA 使用Prime-Script RT試劑盒合成，獲得的cDNA 作為SYBR Greenbased Q-PCR 的模板，采用定量聚合酶鏈反應檢測各組細胞中ATG2A、ATG9A mRNA。引物序列由深圳華大基因有限公司合成，以甘油-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，基 因 序 列 見 文 獻［23］。以2-ΔΔCt表 示 細 胞 中 目的mRNA的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4 各組細胞中ATG2A、ATG9A、P62、微管蛋白1輕鏈3（LC3）蛋白檢測及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ測算采用Western Blotting 法。取各組細胞，用PBS洗滌2次，收集細胞，加入等體積通用蛋白裂解液（內(nèi)含1μmol/L 的蛋白酶抑制劑），4 ℃裂解30 min；4 ℃條件下13 500 r/min離心15 min提取細胞總蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒測定總蛋白濃度。蛋白變性后，取30μg總蛋白上樣，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量用8%、10%和15%凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，放入5%血清白蛋白（BSA）中，常溫封閉2 h，輕輕搖動以阻斷非特異性結(jié)合，加入一抗LC3B（1︰2 000）、P62（1︰2 000）、ATG2A（1︰5 000）、ATG9A（1︰5 000）、βactin（1︰5 000），4 ℃孵育過夜，磷酸緩沖鹽溶液（PBST）洗膜3 次，每次10 min，加入配好的二抗（兔抗或鼠抗），室溫下?lián)u床孵育2 h，PBST 洗滌3 次，每次10 min，化學發(fā)光ECL 孵育1 min 后成像系統(tǒng)進行顯影，以β-actin 為內(nèi)參，使用Image Lab 軟件對目的條帶進行灰度值分析，計算目的蛋白灰度值與β-actin 灰度值的比值，即為目的蛋白的相對表達量，并計算LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ。實驗重復3 次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞中ATG2A、ATG9A mRNA 相對表達量比較 各組細胞中ATG2A、ATG9A mRNA 相對表達量比較見表1。由表1 可知，與對照組、Baf-A1 組相比，EBSS 組、EBSS + Baf-A1 組細胞中ATG2A、ATG9A mRNA相對表達量均顯著升高（P均<0.05），且EBSS+Baf-A1 組細胞中ATG9A mRNA 相對表達量高于EBSS組（P均<0.05）。

表1 各組細胞中ATG2A、ATG9A mRNA相對表達量比較（±s）

表1 各組細胞中ATG2A、ATG9A mRNA相對表達量比較（±s）

注：與對照組相比，*P<0.05；與Baf-A1組相比，#P<0.05；與EBSS組相比，&P<0.05。

組別EBSS+Baf-A1組EBSS組Baf-A1組對照組ATG2A mRNA 2.22±0.29*#2.36±0.11*#0.96±0.02 1.00±0.01 ATG9A mRNA 2.13±0.20*#&1.80±0.13*#1.20±0.12 1.00±0.07

2.2 各組細胞中ATG2A、ATG9A、P62 蛋白相對表達量及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比較 各組細胞中ATG2A、ATG9A、P62 蛋白相對表達量及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比較見表2。由表2可知，與對照組、Baf-A1組相比，EBSS組、EBSS+Baf-A1組細胞中ATG2A蛋白相對表達量均顯著升高（P均<0.05）；EBSS 組細胞中ATG9A 蛋白相對表達量均高于其余三組（P均<0.05）；EBSS 組細胞中P62 蛋白相對表達量均低于其余三組（P均<0.05），EBSS+Baf-A1組P62蛋白相對表達量低于對照組（P均<0.05）；EBSS 組細胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ均低于其余三組（P均<0.05），EBSS + Baf-A1 組LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ均高于其余三組（P均<0.05）。

表2 各組細胞中ATG2A、ATG9A、P62蛋白相對表達量、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白表達比值比較（±s）

表2 各組細胞中ATG2A、ATG9A、P62蛋白相對表達量、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白表達比值比較（±s）

注：與對照組相比，*P<0.05；與Baf-A1組相比，#P<0.05；與EBSS組相比，&P<0.05。

組別EBSS+Baf-A1組EBSS組Baf-A1組對照組ATG2A 1.59±0.19*#1.60±0.02*#0.91±0.26 1.00±0.00 ATG9A 1.43±0.10&2.40±0.69*#1.24±0.17 1.00±0.00 P62 0.87±0.04*&0.63±0.09*#0.90±0.07 1.00±0.00 LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ2.29±0.19*#&0.67±0.14*#1.19±0.01 1.00±0.00

3 討論

研究［14-15］顯示，LC3的蛋白水解切割是自噬體形成的必要步驟，LC3 有三種亞蛋白LC3A、LC3B 和LC3C，其中LC3B 參與自噬體成熟和自噬體與溶酶體的融合過程，作為自噬的分子標志。LC3 蛋白在細胞內(nèi)有兩種存在形式，分別為胞漿可溶性的LC3-Ⅰ和脂質(zhì)化形式LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ是惟一一種在吞噬體到溶酶體降解的整個過程中特異性定位于自噬結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的大小可評估自噬水平的高低［16-17］。在自噬過程中，LC3B-Ⅱ在溶酶體中降解是監(jiān)測自噬過程的標記物，其中結(jié)合的LC3B-Ⅱ的增加可能是結(jié)合在自噬體上的LC3B-Ⅱ增加或溶酶體降解LC3B-Ⅱ減少，所以需要用Baf-A1 來監(jiān)測LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ的水平變化，輸送至溶酶體LC3B-Ⅱ的量反映了正在進行的自噬流的量［18］。P62 是自噬流的重要指標，通過直接結(jié)合自噬膜上的LC3B 并被自噬選擇性降解［19］。本研究結(jié)果顯示，饑餓可誘導自噬，饑餓時LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ和P62 蛋白表達水平下降，LC3B-Ⅱ和P62 蛋白通過溶酶體途徑降解，Baf-A1 對自噬體和溶酶體結(jié)合的抑制導致LC3B-Ⅱ積累和P62 蛋白表達水平恢復至對照組水平，這種積累代表著在饑餓期間通過自噬降解的LC3B-Ⅱ和P62 的量。本研究結(jié)果與以下研究發(fā)現(xiàn)相符：短時間饑餓后，LC3-Ⅰ的量減少，LC3-Ⅱ的量增加，當細胞遭受更長時間的饑餓，LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ都會消失［20］；饑餓期間P62表達顯著減少，加入自噬抑制劑Baf-A1 后P62 積累［21，16］。同時LC3B-Ⅱ的增加與P62 的降低并不具有一致性，要想正確評價自噬流受阻或自噬系統(tǒng)受損應當檢測LC3B 的轉(zhuǎn)化，也要檢測可溶性和不可溶性P62 的變化［22］。由此表明，EBSS 可成功誘導MDA-MB-231 細胞發(fā)生自噬。

ATG2A 定位于吞噬泡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的交界處，參與自噬膜形成，促進自噬體的延伸與閉合［9，23］。本研究結(jié)果中，在MDA-MB-231 細胞中ATG2A 促進自噬，這與YUSUKE 等［11，24］的研究結(jié)果一致，在HeLa 細胞中，ATG2A 是惟一上調(diào)的ATG 基因，且ATG2A 的缺乏將HeLa 細胞和白血病細胞從細胞保護性自噬轉(zhuǎn)變?yōu)榈蛲?。在哺乳動物細胞中，ATG2A 的缺失會導致自噬流量的阻斷并積累未成熟自噬體膜，這些膜通過細胞內(nèi)死亡誘導信號復合物促進Caspase-8 激活以響應營養(yǎng)缺乏，通過抑制自噬體的形成來選擇性地阻斷自噬通量，將細胞保護性自噬轉(zhuǎn)化為細胞凋亡［11］。研究［25］表明，高水平的ATG2A 與肝癌患者的生存期差有關(guān)，而ATG2A 沉默顯著抑制肝癌細胞的惡性程度，ATG2A 作為肝癌的一個潛在的新型治療靶點。自噬通過提供腫瘤微環(huán)境中細胞增殖和代謝所需能量來促進腫瘤生長，高自噬通量與患者預后差、轉(zhuǎn)移增強和化療耐藥有關(guān)。因此，通過靶向ATG2A 對自噬體膜形成的作用，抑制自噬體膜閉合可能是一種新的癌癥治療靶點。

ATG9 是ATG 核心蛋白中惟一的跨膜蛋白，對自噬體膜的形成和延伸具有重要作用［26］。ATG9 分為A、B兩型，其中ATG9A 一般存在于高爾基體膜和內(nèi)體中，在饑餓期間，被運輸?shù)阶允审w形成位點［27］。本研究發(fā)現(xiàn)在饑餓誘導的MDA-MB-231 細胞自噬中，ATG9A mRNA 和蛋白相對表達量顯著上升。分析其原因，有以下兩個方面：第一是PI3P 促進ATG9A 運載并定位膜到自噬小體［28］，本實驗中饑餓誘導后自噬水平升高，因此ATG9A 表達上升；第二是饑餓或雷帕霉素處理期間ATG9 囊泡合成增加可能有助于自噬活性的上調(diào)［29］，與本研究結(jié)果一致。因此，ATG9A 在自噬小體形成階段起著重要的作用，因此在本研究中ATG9A 可作為自噬檢測的重要影響因子，同時也作為三陰性乳腺癌治療的潛在靶點。

綜上所述，EBSS 成功誘導MDA-MB-231 細胞發(fā)生自噬，饑餓誘導的MDA-MB-231 細胞自噬過程中ATG2A、ATG9A 基因表達升高，可作為三陰性乳腺癌治療的潛在靶點。本研究對ATG2A 和ATG9A 在EBSS 處理MDA-MB-231 細胞自噬過程中的作用進行了初步的探討，但是兩個基因在該細胞中自噬的分子機制需要進一步研究。我們將進一步探索其蛋白后修飾對自噬的調(diào)控作用，以及借用siRNA 干擾技術(shù)分別敲降以上兩個基因的表達水平，探索其在不同乳腺癌細胞的具體分子機制，進一步找出三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的分子靶點。自噬可以支持細胞在各種應激如饑餓或缺氧的反應中存活，同時自噬也有作為抗癌靶點的潛力。靶向自噬相關(guān)蛋白和自噬可以為靶向易受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激影響的腫瘤細胞提供一種新的協(xié)同機制［30］。