吳澤鈺，趙今，王琛，龔怡，薛瑞

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（附屬口腔醫(yī)院）牙體牙髓病科，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊（830054）；2.新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊（830054）；3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（附屬口腔醫(yī)院）口腔黏膜中西醫(yī)結(jié)合科，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊（830054）

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是口腔黏膜疾病中一種常見(jiàn)的慢性炎性疾病，WHO將其列入癌前狀態(tài)的范疇。其病因不明確，可能與免疫因素［1］、感染因素、內(nèi)分泌因素等有關(guān)，所以其治療也多以免疫抑制劑為主［2］，如糖皮質(zhì)激素、羥氯喹［3］等。研究發(fā)現(xiàn)，衛(wèi)矛科植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）有很強(qiáng)的抗炎作用，可抑制體液免疫，同時(shí)對(duì)細(xì)胞免疫有雙向調(diào)節(jié)作用，口服雷公藤總苷片是一種有效的OLP治療方法［4］。然而雷公藤的毒副作用大［5］、藥效成分和作用機(jī)制不明確又使許多醫(yī)師及患者望而卻步。因此探尋雷公藤治療OLP的主要成分及其作用機(jī)制為雷公藤制劑應(yīng)用于臨床的必經(jīng)之路。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)人類(lèi)疾病的復(fù)雜程度遠(yuǎn)比最初預(yù)想的要復(fù)雜得多，它們往往是由多個(gè)分子異常引起的，而不是由單一缺陷引起。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，可以在靶蛋白、生物功能和生物活性物質(zhì)的基礎(chǔ)上形成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，能夠在分子水平上從系統(tǒng)的角度闡明中藥的作用機(jī)理，成為中藥研究的一種新方法。該方法已被應(yīng)用于指導(dǎo)和協(xié)助藥物重新定位，發(fā)揮治療作用的藥物可以直接作用于疾病相關(guān)蛋白，也可以調(diào)節(jié)病理過(guò)程中涉及的通路［6］。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的思路和方法篩選雷公藤治療OLP活性成分，探尋其作用靶點(diǎn)，以經(jīng)濟(jì)有效的方式從計(jì)算生物信息學(xué)角度闡明雷公藤治療OLP的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為雷公藤治療OLP的機(jī)制探究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和藥效保障。

1 資料和方法

1.1 篩選雷公藤活性組分和靶點(diǎn)

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、中藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Traditional Chinese Medicine integrated database，TCMID）中檢索“雷公藤”，得到雷公藤的成分及作用靶點(diǎn)。利用PubChem和ChemBL確定成分的三維結(jié)構(gòu)，建立雷公藤組分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。

1.1.1 雷公藤活性組分的篩選 本研究篩選口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，化合物類(lèi)藥性（drug likeness，DL）≥0.18，及該活性化合物在雷公藤中的占比，及OLP防治潛力作為篩選條件。

1.1.2 OLP靶點(diǎn)基因的篩選 通過(guò)在Gene Cards、DisGeNET、DrugBank和OMIM中輸入“oral lichen planus”等關(guān)鍵詞等搜索相關(guān)基因，得到的疾病靶點(diǎn)與雷公藤治療靶點(diǎn)篩選出共同靶點(diǎn)，作為雷公藤治療OLP的潛在靶點(diǎn)。

1.2 化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

利用Cytoscape 3.7.2軟件將雷公藤篩選出的化學(xué)成分、治療靶點(diǎn)導(dǎo)入，構(gòu)建“化學(xué)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，分析拓?fù)鋵傩?，?jié)點(diǎn)越多，度值越大，節(jié)點(diǎn)的中介中心度（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）以及拓?fù)湎禂?shù)（topological coefficient，TC）等信息通過(guò)該軟件分析計(jì)算得出［7］，篩選網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲械年P(guān)鍵藥物成分，分析主要作用靶點(diǎn)及潛在作用機(jī)制。

1.3 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)

在STRING 11.0［8］數(shù)據(jù)庫(kù)中會(huì)對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)的相互作用信息打分，其分值越高蛋白質(zhì)的互作置信度越高。輸入靶點(diǎn)，得到分值>0.4的高置信度蛋白相作數(shù)據(jù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Network Analyzer分析拓?fù)鋵傩浴?/p>

1.4 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

使用Cluster Profiler軟件包［9］，找出顯著富集的生物學(xué)注釋?zhuān)瑢?duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析及KEGG富集分析，篩選P<0.01，結(jié)果利用R 3.6.1可視化。

1.5 雷公藤化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將代謝通路信息、核心靶點(diǎn)和雷公藤活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.7.2中，利用“Merge”功能將其融合，構(gòu)建“雷公藤化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤活性組分的篩選

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)（TCMSP）、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID）獲得雷公藤活性組分51個(gè)，根據(jù)篩選條件共篩選出活性組分23個(gè)，詳見(jiàn)表1。

表1 雷公藤主要活性組分及藥理參數(shù)Table 1 The main active components and pharmacological parameters of Tripterygium wilfordii

2.2 雷公藤和OLP相關(guān)靶點(diǎn)

雷公藤的23個(gè)活性組分在TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得去重后靶點(diǎn)150個(gè)。通過(guò)GeneCards、DisGeNET、DrugBank和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)得到去重后靶點(diǎn)472個(gè)。藥物作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)韋恩分析，得到44個(gè)雷公藤治療OLP的潛在靶點(diǎn)（圖1、表2）。

2.3 構(gòu)建與分析化合成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

如圖2所示，雷公藤化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建。

Figure 1 Venn diagram圖1 韋恩圖

表2 雷公藤治療OLP的潛在活性成分及作用靶標(biāo)Table 2 Potential active ingredients and targets of Tripterygium wilfordii in the OLPtreatment

圖中有69個(gè)節(jié)點(diǎn)（23個(gè)化學(xué)成分，44個(gè)目標(biāo)）和320個(gè)邊。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霰砻鳎骄葦?shù)為4.64，說(shuō)明雷公藤多靶點(diǎn)治療OLP具有多靶點(diǎn)特性，其拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。同時(shí)，可以看出雷公藤中發(fā)揮主要作用的成分雷公藤內(nèi)酯、山奈酚、川陳皮素等。許多靶點(diǎn)與多種成分相關(guān)，這表明雷公藤發(fā)揮藥效過(guò)程中，不同成分之間存在的協(xié)同作用。

2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

STRING數(shù)據(jù)庫(kù)獲得44個(gè)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，共44個(gè)節(jié)點(diǎn)和214個(gè)邊緣，網(wǎng)絡(luò)的平均度值為10.4（圖3a）。節(jié)點(diǎn)反映網(wǎng)絡(luò)中連接“度”的大小，按照度值降序排序篩選出核心靶蛋白30個(gè)，其中以邊緣數(shù)排序前10位的有：腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）、轉(zhuǎn) 錄 因 子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、白細(xì)胞介素4（interleukin 4，IL4）、白細(xì)胞介素8（interleukin 8/C-X-C motif chemokine ligand 8，IL8/CXCL8）、細(xì)胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM1）、轉(zhuǎn)錄因子p65（Transcription factor p65，RELA）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、γ干擾素（interferon gamma，IFNG）（圖3b、表4）。

Figure 2 Tripterygium wilfordii chemical components-targets network diagram圖2 雷公藤化合成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

2.5 GO和KEGG富集分析

對(duì)上述44個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，根據(jù)P<0.01確定了63個(gè)GO條目（表5）。

雷公藤治療OLP的潛在靶點(diǎn)GO富集分析結(jié)果如表5所示，生物過(guò)程（biological process，BP）相關(guān)條目19個(gè)，涉及白細(xì)胞分化、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌起源分子的反應(yīng)等方面（圖4）；分子功能（molecular function，MF）相關(guān)條目33個(gè)，涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白質(zhì)異構(gòu)化活性、血紅素結(jié)合等方面（圖5）；細(xì)胞成分（cellular component，CC）相關(guān)條目11個(gè)，涉及膜筏、膜微結(jié)構(gòu)域、膜區(qū)等方面（圖6）。

KEGG分析得到111條信號(hào)通路，根據(jù)P<0.01篩選出66條通路，繪制氣泡圖（表6、圖7）。包括IL17信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、TNF信號(hào)通路、肺結(jié)核、美洲錐蟲(chóng)病、Toll樣受體信號(hào)通路等通路。

2.6 雷公藤化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

由Cytoscape3.7.2的“Merge”功能構(gòu)建的“雷公藤化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，存在83個(gè)節(jié)點(diǎn)，584條邊緣，平均“度”值為7.06。由圖8可見(jiàn)KEGG富集到的前16個(gè)信號(hào)通路、44個(gè)核心靶點(diǎn)、23個(gè)活性成分間關(guān)系密切。這可能說(shuō)明雷公藤中的多種化合物可以通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路來(lái)達(dá)到潛在治療OLP的作用。

表3 雷公藤化學(xué)成分的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析Table 3 Topological parameter analysis of Tripterygium wilfordii chemical component

Figure 3 Active components of the Tripterygium wilfordii treated OLPprotein-protein interaction圖3 雷公藤活性組分治療OLP的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

表4 雷公藤治療OLP核心靶點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析Table 4 Analysis of the topological parameters of the core target of Tripterygium wilfordii in the OLPtreatment

表5 雷公藤治療OLP的潛在靶點(diǎn)GO富集分析結(jié)果（各前10條）Table 5 GOenrichment analysis results of potential targets of Tripterygium wilfordii for the OLPtreatment(top ten of each items)

Figure 4 Enrichment and analysis of GO biological processes in potential targets of T ripterygium wilfordii for the OLP treatment圖4 雷公藤治療OLP潛在靶點(diǎn)的GO生物學(xué)過(guò)程富集分析

Figure 5 Enrichment and analysis of GO molecular functions in potential targets of Tripterygium wilfordii for the OLP treatment圖5 雷公藤治療OLP潛在靶點(diǎn)的GO分子功能富集分析

Figure 6 Enrichment and analysis of GOcellular components in potential targets of Tripterygium wilfordii for the OLPtreatment圖6 雷公藤治療OLP潛在靶點(diǎn)的GO細(xì)胞成分富集分析

表6 雷公藤治療OLP的潛在靶點(diǎn)KEGG富集分析（前10條）Table 6 KEGGenrichment analysis results of potential targets of Tripterygium wilfordii for OLPtreatment(top 10 of each)

Figure 7 KEGG enrichment analysis of potential targets of Tripterygium wilfordii for the OLPtreatment圖7 雷公藤治療OLP潛在靶點(diǎn)的KEGG富集分析

Figure 8 Tripterygium wilfordii chemical component-target-pathway network diagram圖8 雷公藤化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

雷公藤作為中藥，在我國(guó)有悠久的應(yīng)用歷史，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也證實(shí)雷公藤及其制劑有廣泛的藥理學(xué)作用，對(duì)慢性蕁麻疹、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等難治的自身免疫性疾病有較好療效；對(duì)各類(lèi)腫瘤如乳腺癌、胰腺癌均有顯著療效，并有保護(hù)神經(jīng)的作用，被用于治療阿爾茲海默癥、帕金森綜合征等疾?。?0］。OLP是臨床發(fā)病率僅次于復(fù)發(fā)性阿弗他口腔潰瘍的口腔黏膜及皮膚慢性疾病，并且屬于口腔黏膜潛在惡性疾患，其發(fā)病機(jī)制不明，可能與精神、免疫、感染等多因素相關(guān)。OLP上皮固有層內(nèi)有大量以T淋巴細(xì)胞為主的淋巴細(xì)胞呈密集帶狀浸潤(rùn)，無(wú)論在病損早期、后期均有T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)存在［2］。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建“雷公藤化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”的作用網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)分析雷公藤的化學(xué)成分多通路、多靶點(diǎn)治療OLP的潛在機(jī)制。最終得到23個(gè)活性組分和44個(gè)潛在靶標(biāo)。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，TNF、AKT1、JUN、TP53、IL4、CXCL8、ICAM1、RELA、VEGFA、IFN-γ等蛋白靶點(diǎn)與雷公藤活性成分及OLP相關(guān)性更高，它們可能是雷公藤調(diào)控OLP網(wǎng)絡(luò)的潛在核心調(diào)控因子。

本研究結(jié)果中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示雷公藤內(nèi)酯、山奈酚等匹配多個(gè)靶點(diǎn)，是雷公藤治療OLP的主要成分。雷公藤內(nèi)酯對(duì)炎癥、纖維化、癌癥、病毒感染、氧化應(yīng)激和骨質(zhì)疏松癥具有強(qiáng)大的藥理活性［10］。Wang等［11］證明在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型小鼠中，雷公藤內(nèi)酯可通過(guò)降低TNF-α水平，促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞凋亡，并且其肝毒性小于甲氨蝶呤，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase 3，CASP3）是TNF信號(hào)通路的下游分子，位于細(xì)胞凋亡途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，在暴露于雷公藤內(nèi)酯的終末分化肝細(xì)胞活力顯著下降，CASP3的活性形式增加，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］；雷公藤內(nèi)酯通過(guò)激活抑癌基因p53，抑制肝癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13］。這也與本研究所富集到的靶點(diǎn)及通路一致，也說(shuō)明雷公藤可能通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑、TNF信號(hào)通路等多通路共同調(diào)控以上靶蛋白，對(duì)細(xì)胞免疫進(jìn)行調(diào)控，發(fā)揮其抗炎抗癌作用，從而對(duì)OLP產(chǎn)生治療作用，但仍需進(jìn)一步的體內(nèi)、外研究證實(shí)。

KEGG富集分析中IL17信號(hào)通路占有很大的基因比例。不同種類(lèi)的IL17可激活CASP3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明雷公藤內(nèi)酯可導(dǎo)致輔助性T細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory cells，Tregs）比例失衡，Th17細(xì)胞擴(kuò)增增強(qiáng)，Tregs產(chǎn)生抑制，特別是輔助Th17細(xì)胞分泌的IL17顯著增加［14］。賈沛茹等［15］檢測(cè)到OLP患者外周血中Th17和Treg細(xì)胞比率增加，Th17/Treg平衡被打破，這種平衡紊亂的結(jié)果與臨床上OLP患者病情的嚴(yán)重程度有關(guān)。IFN-γ水平上調(diào)，IL4水平下調(diào)，細(xì)胞免疫增強(qiáng)，這是OLP的易患因素［2］，IL4作為輔助型T細(xì)胞2（T helper 2 cell，Th2）分泌的細(xì)胞因子，可抑制Th17的應(yīng)答［16］。本研究結(jié)果與其具有一致性，說(shuō)明雷公藤內(nèi)酯調(diào)節(jié)IL17信號(hào)通路可能為其治療OLP的一個(gè)方式。但在OLP的治療中雷公藤內(nèi)酯的作用還有待進(jìn)一步研究證明。

在癌細(xì)胞的增殖過(guò)程中，有氧代謝有著非常重要的地位，山奈酚通過(guò)直接作用于抗氧化酶，作為一種抗氧化劑清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生發(fā)揮抗氧化作用［17］，并且其對(duì)未突變的細(xì)胞具有保護(hù)作用，而在突變的細(xì)胞中則會(huì)觸發(fā)細(xì)胞凋亡［18］，這對(duì)治療屬于口腔黏膜潛在惡性疾患的OLP有很大意義，但鮮有研究闡述其肝、腎等毒性，仍需進(jìn)一步研究證明。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步揭示雷公藤治療OLP的主要成分、作用靶點(diǎn)和作用途徑，為將來(lái)從雷公藤中開(kāi)發(fā)出高活性、低毒性的治療OLP的藥物的深入研究提供了理論依據(jù)，但仍需進(jìn)一步的科學(xué)驗(yàn)證。

【Author contributions】 Wu ZY，Wang C，Gong Y analyzed the data and wrote the article，Zhao J，Xue R revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.