姜洪波,孫利偉*,田玉玲,杜 娟,劉宇奇,王利武,馬英偉

(1.長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院 精準(zhǔn)兒童醫(yī)學(xué)中心,吉林 長(zhǎng)春130061；2.吉林省醫(yī)院 腎病科，吉林 長(zhǎng)春130021)

慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD) 已成為關(guān)系全球人類健康的重要疾病之一，全球發(fā)病率約為8%-16%[1]。CKD最終的歸宿是腎功能衰竭。腎衰的發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究腎衰的發(fā)病機(jī)制，一直是臨床急需解決的問(wèn)題。本研究應(yīng)用阿霉素聯(lián)合頭孢噻啶，給大鼠靜脈注射或/和肌肉注射，成功建立了大鼠慢性腎功能衰竭動(dòng)物模型,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康SPF級(jí)SD大鼠，6-8周齡，雄性，體重300 g左右，18只，購(gòu)于重慶恩斯維爾生物科技有限公司。18只動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A組)和模型B組、C組、D組、E組、F組，共計(jì)6組，每組3只大鼠。

1.2 主要儀器設(shè)備電子分析天平(Precisa12A)，為瑞士產(chǎn)品；蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)器，保定蘭格恒流泵有限公司；顯微外科手術(shù)器械包(SSW-3型)，上海手術(shù)器械廠；純水儀，德國(guó)Millipore產(chǎn)品。

1.3 主要試劑(1)PBS磷酸鹽緩沖液。(2)7%水合氯醛，室溫避光保存。(3)4%多聚甲醛。(4)5 mg/ml鹽酸阿霉素：鹽酸阿霉素25 mg，溶于5 ml生理鹽水中。(5)20 mg/ml頭孢噻啶：頭孢噻啶100 mg，溶于5 ml生理鹽水中。(6)尿蛋白定量測(cè)定試劑盒，肌酐測(cè)定試劑盒，尿素氮測(cè)定試劑盒，血清鉀、鈣、磷檢測(cè)試劑盒，均為南京建成產(chǎn)品。(7)HE染色固定液。(8)阿霉素為meilunbio產(chǎn)品(產(chǎn)品編號(hào)：MB1087)、頭孢噻啶購(gòu)自酷爾化學(xué)科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng) 動(dòng)物房12 h-12 h晝夜交替，保持動(dòng)物自由飲水、進(jìn)食，溫度23-25℃，飼養(yǎng)在代謝籠中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)入動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.4.2動(dòng)物建模 實(shí)驗(yàn)鼠稱重并麻醉， B、D、E、F組分別按照6.5 mg/kg的劑量給與阿霉素尾靜脈注射1次，第2天C、D、E、F組分別按照60 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg、70 mg/kg的量于后肢大腿外側(cè)肌肉注射頭孢噻啶，連續(xù)注射3天。A組大鼠給予5ml生理鹽水尾靜脈注射3天。

1.4.3實(shí)驗(yàn)取材 ?尿液取材 將大鼠飼養(yǎng)在代謝籠里，正常提供水和飼料，在完成3天肌注后第3天、7天、14天，收集每只大鼠24 h尿液，用于生化檢測(cè)。?血清取材 在肌注后第14天尾靜脈取血、28天各組大鼠稱重并麻醉，分別取眼眶血和剪開腹腔暴露腹主動(dòng)脈，用止血鉗夾閉腹主動(dòng)脈近心端將采血針插入腹主動(dòng)脈，松開止血鉗將采血管插在采血針另外一頭取血。血液靜置1-2 h后離心(3 000轉(zhuǎn)/min，20 min，4℃)，取上層血清用于生化檢測(cè)。?腎臟取材 在肌注后第28天各組大鼠稱重并麻醉，剪開胸廓暴露心臟，將灌注泵一端針頭插入左心室中，并用止血鉗固定，剪開右心耳，開放靜脈血。首先灌注100 ml-200 ml生理鹽水，再灌注4%多聚甲醛200 ml-300 ml固定。灌注后的大鼠將腹腔剪開取出腎臟放于4%多聚甲醛中固定用于HE檢測(cè)。

1.4.4尿蛋白含量測(cè)定 尿液標(biāo)本應(yīng)用尿蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行尿蛋白檢測(cè)，方法嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.5血清肌酐、尿素氮、血清鉀、鈣、磷含量檢測(cè) 將采集的血液標(biāo)本，檢測(cè)血清肌酐、尿素氮、血清鉀、鈣、磷含量。檢測(cè)方法按試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.6腎臟病理 分別取A、B、C、D、E、F組大鼠的腎臟組織，進(jìn)行組織石蠟包埋、石蠟切片、HE染色，光鏡下觀察腎小球、腎小管間質(zhì)病理形態(tài)學(xué)改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 25.0 軟件。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示， 組間比較采用單因素方差分析，應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠尿量及尿蛋白含量變化

2.1.1尿量比較 模型B、C、D、E、F組與正常對(duì)照A組比較，用藥后第7天和14天尿量均明顯增多，經(jīng)方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(F7天=8.442，P7天=0.001；F14天=47.758，P14天=0.000)。B、C組與D、E、F組比較，在用藥后第3天尿量無(wú)明顯差異；第7天F組尿量較B組(P=0.029)和C組(P=0.014)明顯增多，見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠尿量比較

2.1.2尿蛋白量比較 模型B、C、D、E、F組與正常對(duì)照A組比較，在用藥后第3天、7天、14天尿蛋白量均明顯增高；D、E、F組尿蛋白量均值依次增高；經(jīng)方差分析差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 用藥后大鼠尿蛋白量均值(mg/L)的變化

比較各模型組大鼠結(jié)束用藥后3天、7天、14天尿蛋白量，隨著用藥時(shí)間增多，尿蛋白量也明顯增多， B、C組與D、E、F組比較，用藥后3天，F(xiàn)組較B組， D、E、F組較C組尿蛋白量增多；用藥7天、14天D、E、F組與B、C組尿蛋白量比較均明顯增多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組大鼠用藥后血清肌酐、尿素氮變化在用藥后第14天和28天取血樣檢測(cè)血清肌酐和尿素氮，模型B、C、D、E、F組大鼠血清肌酐和尿素氮均值均明顯升高，與正常對(duì)照A組比較，存在明顯差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。聯(lián)合用藥的D、E、F組與不聯(lián)合用藥的B、C組分別比較，血清肌酐和尿素氮均值亦明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 用藥后大鼠血清肌酐(μmol/L)、尿素氮(mmol/L)均值

2.3 各組大鼠用藥后血鉀、鈣、磷含量變化用藥后第14天、28天模型B、C、D、E、F組大鼠血鉀、血磷增高，血鈣降低；聯(lián)合用藥D、E、F組與單獨(dú)用藥的B組、C組分別比較，用藥后第14天血鉀、血磷增高，血鈣降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；用藥后第28天血鉀、血磷增高，血鈣降低，除血鈣B組與D組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P血鈣=0.106)外，其余各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 各組大鼠腎臟病理改變正常對(duì)照組腎形態(tài)正常，腎結(jié)構(gòu)比較清晰，腎小球比較規(guī)則(圖2)；與正常對(duì)照組比較，B組(阿霉素6.5 mg/kg組)(圖3)、C組(頭孢噻啶60 mg/kg組)(圖4)腎小球系膜細(xì)胞增生，基底膜增厚；阿霉素與頭孢噻啶聯(lián)合作用的D、E、F組的部分腎小球出現(xiàn)分葉狀，腎小囊內(nèi)血漿蛋白滲出，隨著頭孢噻啶濃度的增加，病變病理改變更加明顯，出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張，間質(zhì)損傷，上皮細(xì)胞空泡變性和纖維化；毛細(xì)血管袢分辨不清，見(jiàn)圖5、6、7。

3 討論

我國(guó)慢性腎臟病(CKD)發(fā)病率持續(xù)上升[2],明確發(fā)病原因和臨床表現(xiàn)，進(jìn)行早期診斷和治療有重要的意義。CKD表現(xiàn)為進(jìn)行性和不可逆腎單位特征喪失，腎再生能力降低、微血管損傷、代謝紊亂、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致腎組織纖維化[3]。CKD的原因及發(fā)病機(jī)制多且復(fù)雜；臨床表現(xiàn)多樣，缺乏特異性，主要表現(xiàn)為代謝紊亂，早期癥狀不明顯，當(dāng)出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，病情已經(jīng)進(jìn)展，健康的腎單位已經(jīng)明顯減少，進(jìn)展到衰竭期和尿毒癥期。治療以腎臟透析為主，或進(jìn)行腎移植。CKD的進(jìn)展與急性腎損傷(AKI)和反復(fù)發(fā)作AKI有關(guān)(稱為AKI到CKD轉(zhuǎn)換)。同樣，AKI可以導(dǎo)致CKD的發(fā)展[4]。

表3 用藥后大鼠血清鉀、鈣、磷含量

圖2 A組HE染色腎臟常規(guī)病理 圖3 B組HE染色腎臟病理改變

圖4 C組HE染色腎臟病理改變 圖5 D組HE染色腎臟病理改變

阿霉素為蒽環(huán)類抗生素，是細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物。是經(jīng)典的嚙齒類動(dòng)物腎臟損傷的誘發(fā)劑， 能夠引發(fā)初期腎小球局灶節(jié)段性硬化癥， 能夠很好地模擬人體慢性腎臟損傷過(guò)程。1970 年，Sternberg 首次報(bào)道蒽環(huán)類抗生素能夠引起腎炎[5]。阿霉素可損害腎近曲小管上皮細(xì)胞，使其脫離，并與管腔內(nèi)的蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞成分融合成管型，堵塞管腔，使腎內(nèi)壓增高，產(chǎn)生損傷[6]。阿霉素腎炎動(dòng)物模型的典型特征是用藥幾天之內(nèi)就發(fā)生腎臟的嚴(yán)重?fù)p傷， 但損傷發(fā)生的時(shí)段很穩(wěn)定，且可以預(yù)料，因此動(dòng)物造模過(guò)程中死亡率較低(5%)[7]，造模相對(duì)簡(jiǎn)單，成功率高。

圖6 E組HE染色腎臟病理改變 圖7 F組HE染色腎臟病理改變

頭孢噻啶為頭孢菌素類抗菌藥物，具有腎毒性，可引起腎損害，正常治療劑量尿中即有透明管型出現(xiàn)。每日8 g以上，常會(huì)造成腎小管壞死，表現(xiàn)為蛋白尿、管型尿和血尿、尿素氮升高等，甚至出現(xiàn)少尿或急性腎功能衰竭[8]。早在1966年，Atkinson就成功建立了頭孢菌素腎毒性動(dòng)物模型[9]。但是，阿霉素聯(lián)合頭孢噻啶制備大鼠慢性腎衰竭的動(dòng)物模型，目前未見(jiàn)報(bào)道。頭孢菌素類抗生素在臨床被廣泛應(yīng)用，與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用亦較常見(jiàn)；國(guó)內(nèi)外均有相關(guān)副作用的報(bào)道[10-12]。

本研究成功制備了阿霉素聯(lián)合頭孢噻啶致大鼠慢性腎衰竭的模型，并與單獨(dú)應(yīng)用阿霉素和頭孢噻啶藥物建立的大鼠慢性腎衰竭模型進(jìn)行比較。模型組與對(duì)照組大鼠比較，在造模過(guò)程中尿量、尿蛋白量明顯增多；肌酐和尿素氮明顯增多；血鉀和血磷明顯增高；血鈣降低；均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合用藥組與單獨(dú)用藥組比較，在造模過(guò)程中代謝紊亂更加明顯，表現(xiàn)為尿量增多、尿蛋白升高，血肌酐、尿素氮、血鉀、血磷升高，血鈣降低。慢性腎功能衰竭病理演化過(guò)程是多種因素引起腎小球和腎小管的損傷，持續(xù)損傷造成腎組織萎縮、纖維化[13]。本研究模型組腎小球出現(xiàn)不同程度萎縮硬化的表現(xiàn)。聯(lián)合用藥組出現(xiàn)明顯的腎小管病變，出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張，間質(zhì)損傷，上皮細(xì)胞空泡變性和纖維化；毛細(xì)血管袢分辨不清等病理?yè)p傷。

本研究建立的阿霉素聯(lián)合頭孢噻啶大鼠CKD模型。阿霉素用藥量較少，避免了對(duì)心臟等重要臟器的損傷作用而導(dǎo)致動(dòng)物早期死亡，實(shí)驗(yàn)失敗情況的發(fā)生。阿霉素聯(lián)合頭孢噻啶大鼠CKD模型，造模方法簡(jiǎn)單，腎臟病理?yè)p傷明顯，接近慢性腎衰的臨床實(shí)際。是研究慢性腎功能衰竭發(fā)生機(jī)制、病理?yè)p害及藥物干預(yù)等的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。