蘇真娟,王夢濤

(盤錦市中心醫(yī)院 檢驗科微生物室,遼寧 盤錦124010)

沙眼衣原體是一種傳播廣泛的胞內寄生病原體，最常見于有不潔性生活史的青年人[1]。由于感染者初期多無癥狀，使得沙眼衣原體感染的診斷較為困難[2]。為避免其引起的附睪炎和前列腺炎進而影響男性生育功能，對沙眼衣原體感染的早期診斷變得十分重要[3]。目前診斷沙眼衣原體感染的金標準是基于PCR的核酸擴增技術，盡管該技術具有高度的特異性和敏感性，但耗時長，需要復雜和昂貴的實驗室設備[4]。環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新型、高靈敏度和特異性的診斷工具，其易于操作且耗時短，不需要復雜和昂貴的PCR熱循環(huán)儀，已成為新一代具有潛力的診斷方法[5]。然而，尿液標本的檢測需要事先裂解并從病原體中提取RNA，目前病原體細胞裂解液制備技術大多復雜而耗時，并且需要完全集成的自動化平臺[6]。近年的研究表明抗菌肽作為一種非常有效的支原體裂解劑，可在等溫擴增前作為快速有效的樣品制備劑[7]。因此，本研究擬將LAMP技術與抗菌肽裂解法相結合，從而快速、靈敏地檢測人尿中的沙眼衣原體。

1 研究方法

1.1 臨床標本采集選取盤錦市中心醫(yī)院2019年12月至2020年06月接受尿液衣原體檢測的患者100例，患者年齡18-33歲，女性44例，男性56例，排除抗生素使用史及細菌感染患者，由患者自行收集清晨第一次尿液樣本20-25 ml到清潔聚丙烯小皿中，并且在1天內接受檢測。根據(jù)我院常規(guī)采用沙眼衣原體(CT)/淋球菌(NG)質控試劑盒(羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司)以定量PCR法檢測沙眼衣原體感染。

1.2 引物設計和篩選選擇沙眼衣原體隱性質粒作為目的基因，使用在線引物比對工具BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)及LAMP引物設計軟件LAMP Designer 1.10設計沙眼衣原體特異性LAMP引物及環(huán)狀引物以加快擴增時間，提高靈敏度。并且使用Oligo Analyser tool對引物進行復篩，引物設計原則：引物對DNA位點有較高的敏感性，環(huán)狀引物上沒有非特異性背景，盡量避免含有易形成二級結構、發(fā)夾或分子相互作用的序列并且綜合Tm 值、△G 值、GC 含量等參數(shù)。最終得到了LAMP引物6條，由上海生工生物工程有限公司合成，采用生物素標記引物FIP和LF的5’末端，采用FAM標記BIP和LB引物的5’末端，見表1。

1.3 抗菌肽樣本預處理每30 μl尿液樣本中加入4 μl 1×抗菌肽裂解液(德國SelfD生物技術有限公司)后在90℃下預熱5 min，然后置于冰上冷卻，取5 μl裂解物用后續(xù)實驗，另取5 μl未作裂解處理的尿液作為對比。

1.4 實時熒光 LAMP反應使用LAMP反應試劑盒(海研拓生物科技有限公司)，反應為40 μl體系，其中包括5 μl裂解后或未處理的尿液、2×LAMP反應Mix10 μl、25 mM MgCl23 μl、8 U/μL Bst DNA聚合酶1.5 μl、0.5 μl SyberGreen熒光染料、0.3 μl ROX(美國賽默飛生物科技有限公司)和引物(見表1)；引物的終濃度分別為FIP/BIP 0.8 μM，F(xiàn)3/B3 0.2 μM，LF/LB 0.4 μM，然后補水至40 μl。使用Applied Biosystems 7900HT(美國賽默飛生物科技有限公司)實時PCR系統(tǒng)進行反應，反應溫度為 64 ℃，每循環(huán)1 min，共40個循環(huán)，重復3次，每次實驗均以雙蒸水為模板作為陰性對照。

表1 引物信息表

1.5 特異性實驗以6種其他的常見菌株(大腸埃希菌、屎腸球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、副溶血鏈球菌)作為特異性檢測實驗，檢測有無非特異性擴增曲線。使用 BHI 固體培養(yǎng)基(Oxoid 公司)培養(yǎng)上述菌株后挑取單菌落用核酸快速提取試劑盒(QIAGEN公司)提取DNA用于 LAMP 擴增檢測，反應條件中將5 μl尿液替換為1.2 μl DNA模板，其余條件同上，每一樣本重復3次。

1.6 靈敏性實驗取步驟4中的PCR產(chǎn)物，采用UltraPureTMAgarose(美國賽默飛生物科技有限公司)進行核酸電泳純化后檢測DNA濃度并且根據(jù)產(chǎn)物長度計算基因拷貝數(shù)，據(jù)此進行濃度梯度稀釋再進行 LAMP 反應靈敏性實驗。

1.7 臨床驗證實驗以PCR熒光法檢測作為金標準評估LAMP實驗的臨床性能，以靈敏度、特異度、準確度及一致率作為真實性評價指標，靈敏度為LAMP實驗陽性人數(shù)在金標準(PCR熒光法)陽性人數(shù)中所占比例，特異度為LAMP實驗陰性人數(shù)在金標準陰性人數(shù)中所占比例，準確度為靈敏度+特異度-1，一致率為兩種方法結果一致(均為陽性或陰性)人數(shù)在總受試對象中所占比例。

2 結果

2.1 LAMP反應

與未接受抗菌肽裂解處理的尿液樣本相比，裂解后樣本反應效率大幅提高，10循環(huán)左右即可達到平臺期，見圖1。

圖1 尿樣沙眼衣原體隱性質粒LAMP擴增曲線

A 未接受抗菌肽裂解處理的尿液樣本的LAMP擴增曲線 B接受抗菌肽裂解處理的尿液樣本的LAMP擴增曲線

2.2 特異性實驗

測試所用6種常見病原菌在LAMP擴增實驗中均未出現(xiàn)特異性曲線，僅沙眼衣原體樣本出現(xiàn)了特異性擴增，可見沙眼衣原體與其他病原菌在LAMP實驗中無交叉反應，見圖2。

圖2 尿樣沙眼衣原體隱性質粒LAMP擴增特異性實驗

2.3 靈敏性實驗

將 LAMP實驗所得產(chǎn)物純化后，測得DNA濃度為 45.66 ng/μL。將其稀釋至 10-5、10-6、10-7、10-8、10-95個濃度梯度進行 LAMP 實驗，按10循環(huán)計算對應模板量為 4.46×10-7、4.46×10-8、4.46×10-9、4.46×10-10、4.46×10-11ng/μL。隨著模板濃度降低，到達平臺期的循環(huán)數(shù)增加，但在4.46×10-11ng/μL模板濃度下仍能在25循環(huán)左右到達平臺期完成LAMP擴增，見圖3。

圖3 尿樣沙眼衣原體隱性質粒LAMP擴增靈敏性實驗

2.4 臨床驗證實驗

100例受試者中，經(jīng)醫(yī)院定量PCR法測定沙眼衣原體陽性42例，未經(jīng)裂解肽處理的尿樣LAMP實驗敏感度、特異度、準確度及一致率均低于抗菌肽裂解聯(lián)合LAMP實驗法，見表2。

3 討論

人群中沙眼衣原體感染率高達12.3%-17.4%，而其可導致多種泌尿生殖道疾病發(fā)生，早期診斷對沙眼衣原體感染的有效干預十分重要[8]，而人尿成分復雜，其中多種成分會影響擴增反應的效率。例如，尿液中的尿素會導致聚合酶降解[9]。因此，PCR技術檢測尿液標本時除昂貴費時等缺點外還極易受到尿液中其他物質的干擾以致結果失準。LAMP技術通過設計一組靶基因特異性引物，其可以自身重復發(fā)生鏈置換合成反應，從而在恒溫條件下實現(xiàn)核酸的快速擴增，不需PCR技術所依賴的溫度循環(huán)設備[10]。而在LAMP實驗中引入抗菌肽裂解步驟，可以提高直接從尿樣中檢測沙眼衣原體的能力，而無需事先提取、純化和濃縮病原體遺傳物質[11]。

表2 尿樣沙眼衣原體隱性質粒LAMP擴增真實性實驗(n,%)

在本研究中，我們選擇沙眼衣原體隱性質粒作為擴增目的基因，隱性質粒是沙眼衣原體中一種相對穩(wěn)定的核酸靶點，相比基因組DNA更能抵抗核酸酶的損傷，且其在基因組中至多可有10個拷貝，相比單拷貝基因敏感度更高[12]。在LAMP反應中至少應有一對外游引物(F3/B3)及一對內游引物(FIP/BIP)，我們的研究中增加了一對環(huán)引物(LF/LB)，相比之前的報道具有更高的特異性，而且可以加快擴增時間[13-14]。更重要的是，先前王雪亮及李若琳等人的研究均需在體外實現(xiàn)提取樣本沙眼衣原體中的遺傳物質并進行濃縮純化，目前關于使用LAMP技術直接在臨床樣本中進行檢測的報道十分有限?？咕囊驯蛔C明是一類高效的抗菌劑，其通過識別感染衣原體細胞表面的高負電荷密度并形成特殊二級結構插入到脂質雙分子層中穿透細胞膜進而裂解病原體[15]。我們的研究創(chuàng)新性地在LAMP擴增前使用抗菌肽來釋放衣原體DNA從而快速有效制備待檢樣本。由于不需事先提取和純化DNA，使得整個檢測過程變得簡單而省時。傳統(tǒng)PCR定量技術需要60 min左右的擴增時間，而聯(lián)合抗菌肽裂解法的LAMP擴增僅需十余分鐘即可達到平臺期，由于直接使用尿液樣本難以避免其他微生物的干擾，我們設計了特異性實驗，使用了6種常見病原菌來測試使用該方法檢測沙眼衣原體與其他病原菌的交叉反應，結果顯示其特異性良好，不會受到雜菌污染的影響。敏感性實驗中即使模板DNA被稀釋10-9倍反應仍能在25循環(huán)左右到達平臺期，可見本方法穩(wěn)定性良好，不容易受到樣本稀釋的影響。臨床樣本的真實性實驗中未經(jīng)裂解肽處理的尿樣LAMP實驗敏感度、特異度均在74%左右，可見未經(jīng)裂解及DNA富集的LAMP實驗檢測效能欠佳，而抗菌肽裂解聯(lián)合LAMP實驗法的敏感度、特異度提高至83.3%及86.2%，一致率達85.0%，可以實現(xiàn)尿液衣原體快速且高效檢測，尤其是在大規(guī)模人群篩查中極具優(yōu)勢。后續(xù)有待進一步擴大樣本的檢測量以進一步驗證其檢測效能及穩(wěn)定性。

聯(lián)合抗菌肽裂解法的環(huán)介導等溫擴增技術能實現(xiàn)尿液沙眼衣原體的快速檢測，且特異度、靈敏度及臨床性能較好，具有一定臨床應用前景。