郜靚 梁丹妮 楊紅霞肖遠(yuǎn)燦魏立新杜玉枝*

（1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，青海省藏藥藥理學(xué)與安全性評(píng)價(jià)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧810008； 2.中國(guó)科學(xué)院藏藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧810008； 3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

骨質(zhì)疏松癥是由于雌激素不足、增齡衰老、內(nèi)分泌功能紊亂等多種病因?qū)е碌囊怨橇縼G失、結(jié)構(gòu)改變、生物力學(xué)性能減退、易發(fā)生骨折為特點(diǎn)的全身性骨代謝疾病，影響了全世界大多數(shù)老年人的生活。近幾年流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)約有老齡人口1.3 億，而骨質(zhì)疏松癥患者就達(dá)8 400 萬，預(yù)計(jì)到2050年老齡人口將達(dá)到2.5 億，其中25%～70%可能患有該疾?。?］。全球每年因骨質(zhì)疏松引起的骨折約有900 萬例［2］，目前已被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為十大最嚴(yán)重疾病之一［3］。本實(shí)驗(yàn)采用維甲酸制備骨質(zhì)疏松癥模型，它是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥最常見的病因之一［4］，模型大鼠在發(fā)病癥狀、組織學(xué)表現(xiàn)、對(duì)雌激素的反應(yīng)方面與人類有較高的相似性［5］。

牦牛主要分布于喜馬拉雅山脈和青藏高原，藏醫(yī)常用其骨、髓入藥，《四部醫(yī)典》 中有用骨汁藥浴和三味骨精湯治療各種骨質(zhì)增生、骨質(zhì)疏松、骨性關(guān)節(jié)病等骨疾病的記載［6］。已有研究表明，牦牛骨粉不僅可顯著增加骨密度，而且與相應(yīng)劑量的碳酸鈣比較具有較高的鈣表觀吸收率［7?8］，并且含有大量K、Na、Ca、Mg、Mn、Fe、Zn 等人體必需元素［9］，鈣磷比例為2∶1，可作為良好的補(bǔ)鈣劑［10］。因此，本實(shí)驗(yàn)考察復(fù)方牦牛骨粉對(duì)維甲酸誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 8～10 周齡的SPF 級(jí)SD 大鼠72 只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（甘）2015?0002。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作過程依照中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的要求執(zhí)行。

1.2 試劑與藥物 維甲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；水合氯醛（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。朗迪碳酸鈣D3片（Ⅱ）（北京振東康遠(yuǎn)制藥有限公司，批號(hào)20181074）；復(fù)方牦牛骨粉（牦牛骨粉、脫脂牦牛骨髓、牦牛皮膠、牦牛奶粉按12∶1∶4∶3 比例混合均勻，添加50 mL 純水，水浴37 ℃ 加熱攪拌至完全溶解，專利號(hào)ZL201610061603.1）。Co60輻照鈣缺乏繁殖型純化鼠飼料（北京華博德億生物技術(shù)有限公司）。大鼠BGP、TRAP 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，血清ALP、Ca2＋、P 生化檢測(cè)試劑盒（江萊生物科技有限公司）。

1.3 儀器 直接數(shù)字化雙能X 線骨密度檢測(cè)儀（美國(guó)GE Healthcare 公司）；多排定量小型動(dòng)物CT、多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)PerkinElmer 公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）。

1.4 方法

1.4.1 造模及分組 72 只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，即空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（碳酸鈣D3片）及復(fù)方牦牛骨粉低、中、高劑量組，除空白組外，其余各組大鼠連續(xù)灌胃給予維甲酸（70 mg／kg）14 d［11］。模型成立后，空白組、模型組大鼠以純水灌胃（0.1 mL／10 g），其余各組大鼠分別灌胃給予陽(yáng)性藥碳酸鈣D3片（74.74 mg／kg，臨床等效劑量）［12］、低劑量復(fù)方牦牛骨粉（4.67 mg／kg，臨床等效劑量的1／16）、中劑量復(fù)方牦牛骨粉（18.69 mg／kg，臨床等效劑量的1／4）、高劑量復(fù)方牦牛骨粉（37.37 mg／kg，臨床等效劑量的1／2），每天1 次，連續(xù)4 周。

1.4.2 體質(zhì)量測(cè)定 每周稱定大鼠體質(zhì)量，并根據(jù)體其變化調(diào)整給藥量。于造模前后及給藥4 周后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)大鼠體質(zhì)量進(jìn)行增長(zhǎng)率比較。

1.4.3 骨密度（BMD）測(cè)定 給藥4 周后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，采用雙能X 射線骨密度儀進(jìn)行全身掃描，檢測(cè)股骨、脊椎、全身骨密度。

1.4.4 血液指標(biāo)檢測(cè) 于造模前后及給藥4 周后大鼠眼球采血，采用試劑盒對(duì)血清鈣（Ca2＋）、磷（P）、骨鈣素（BGP）水平及堿性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸性磷酸酶（TRAP）活性，分析其變化趨勢(shì)。

1.4.5 Micro?CT 掃描 給藥4 周后，取大鼠右側(cè)股骨及腰椎L1?L4段，除去筋膜，4% 多聚甲醛固定，將大鼠股骨及腰椎標(biāo)本固定在Micro?CT 動(dòng)物床上，上下掃描200 層，掃描電壓90 kV，電流88 μA，視野36 mm。采用Caliper Analyze 軟件，對(duì)大鼠股骨及腰椎組織體積（TV）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV／TV）、骨表面積組織體積比（BS／TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、骨小梁厚度（Tb.Th）進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD?t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量增長(zhǎng)率 與造模前比較，空白對(duì)照組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)幅度最顯著，其余各組基本相同；給藥4 周后，模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)幅度最小，而各給藥組均有所增加，其中復(fù)方牦牛骨粉組其漲幅與給藥劑量成正比。見圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化Fig.1 Weight changes of rats in various groups

2.2 BMD 與空白組比較，模型組大鼠股骨、脊椎及全身BMD 降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和各給藥組大鼠股骨、脊椎及全身BMD 升高，而且除復(fù)方牦牛骨粉低劑量組外，其余各組均升高（P＜0.05，P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠BMD（， n＝12）Tab.1 BMDs of rats in various groups（， n＝12）

表1 各組大鼠BMD（， n＝12）Tab.1 BMDs of rats in various groups（， n＝12）

注：與空白組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 血液指標(biāo) 與空白組比較，模型組大鼠血清Ca2＋、ALP、BGP、TRAP 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），血清P 水平無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、各給藥組大鼠血清ALP水平降低（P＜0.01），復(fù)方牦牛骨粉中、高劑量組大鼠血清Ca2＋水平降低（P＜0.05，P＜0.01），P、TRAP 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），見表2、圖2。

圖2 各組大鼠血液指標(biāo)變化（， n＝12）Fig.2 Changes of blood indices in rats in various groups（， n＝12）

表2 各組大鼠血液指標(biāo)（， n＝12）Tab.2 Blood indices in rats in various groups（， n＝12）

表2 各組大鼠血液指標(biāo)（， n＝12）Tab.2 Blood indices in rats in various groups（， n＝12）

注：與空白組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 Micro?CT 與其他各組比較，模型組TV 更低，BV／TV 無明顯變化（P＞0.05）；BS／TV 高于空白組及復(fù)方牦牛骨粉中、高劑量組（P＜0.05，P＜0.01）；除陽(yáng)性對(duì)照組外，模型組Tb.N 與其他各組比較無明顯變化（P＞0.05）；模型組Tb.Sp高于空白組及復(fù)方牦牛骨粉低劑量組（P＜0.05），Tb.Th 低于空白組及復(fù)方牦牛骨粉中、高劑量組（P＜0.05，P＜0.01），見圖3、表3。

圖3 各組大鼠股骨Micro?CT圖Fig.3 Micro?CT images for the femurs of rats in various groups

表3 各組大鼠股骨CT 參數(shù)（， n＝12）Tab.3 CT parameters of the femurs of rats in various groups（， n＝12）

表3 各組大鼠股骨CT 參數(shù)（， n＝12）Tab.3 CT parameters of the femurs of rats in various groups（， n＝12）

注：與空白組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

除復(fù)方牦牛骨粉低劑量組外，模型組TV 與其他各組比較無明顯變化（P＞0.05）；模型組BV／TV 低于空白組及復(fù)方牦牛骨粉中、高劑量組（P＜0.05）；除復(fù)方牦牛骨粉低劑量組外，模型組BS／TV 高于其他各組（P＜0.01）；模型組Tb.N 小于復(fù)方牦牛骨粉低劑量組（P＜0.05）；各組Tb.Th、Tb.Sp 無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見圖4、表4。

圖4 各組大鼠腰椎Micro?CT圖Fig.4 Micro?CT images for the lumbar spines of rats in various groups

表4 給藥干預(yù)后各組大鼠腰椎CT 參數(shù)（， n＝12）Tab.4 CT parameters of the lumbar spine of rats in various groups after drug intervention（， n＝12）

表4 給藥干預(yù)后各組大鼠腰椎CT 參數(shù)（， n＝12）Tab.4 CT parameters of the lumbar spine of rats in various groups after drug intervention（， n＝12）

注：與空白組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥的定義為“以骨量減少、骨顯微結(jié)構(gòu)退化為特征，導(dǎo)致骨強(qiáng)度降低而易發(fā)生骨折的全身性骨代謝疾?。?3］?！币虼耍魏文軌蚍乐喂琴|(zhì)疏松癥的藥物必須是能阻止骨量減少，改善骨顯微結(jié)構(gòu)退化和保持骨代謝平衡的藥物。骨量、骨代謝生化標(biāo)志物和骨顯微結(jié)構(gòu)的變化因此成為檢測(cè)骨質(zhì)疏松癥治療或預(yù)防藥物的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。而骨密度作為診斷骨質(zhì)疏松和骨折危險(xiǎn)程度的重要指標(biāo)，目前被認(rèn)為是反映骨質(zhì)疏松的黃金標(biāo)準(zhǔn)［14］，也是判斷藥物是否有效的關(guān)鍵指標(biāo)，其檢測(cè)結(jié)果目前已被廣泛應(yīng)用于臨床治療及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究中。

牦牛骨含有多種人體必需元素以及多糖、氨基酸、磷蛋白、軟骨素和骨膠原等營(yíng)養(yǎng)成分，既可直接服用也可以作為補(bǔ)充鈣源的添加劑使用，而且牦牛骨中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例接近1∶1，與膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量（DRIs）推薦人體攝入脂肪酸的組成比例相符［15］，其促進(jìn)骨骼發(fā)育和骨傷愈合的成分含量遠(yuǎn)高于一般食草動(dòng)物的骨骼［16］。

本實(shí)驗(yàn)中，血清骨代謝指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果顯示，維甲酸誘導(dǎo)提高了血清中ALP 的活性，增加了血清Ca2＋、BGP 含量，證實(shí)維甲酸誘導(dǎo)后骨轉(zhuǎn)化增強(qiáng)，與相關(guān)的研究相符［17?19］，也證明本研究中大鼠高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松模型造模成功。但給藥組TRAP 活性高于模型組，可能提示復(fù)方牦牛骨粉對(duì)維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠骨吸收無明顯抑制作用［20］。在給予不同劑量的復(fù)方牦牛骨粉后血清中ALP 活性和BGP 的含量有所下降，同時(shí)隨給藥劑量的增加，血清中的Ca2＋含量顯著降低，提示骨形成明顯增強(qiáng)［21?22］。

腰椎和股骨是BMD 以及骨微結(jié)構(gòu)常用的檢測(cè)部位［23］，骨小梁結(jié)構(gòu)是影響骨強(qiáng)度的關(guān)鍵因素［24］。目前有研究表明，BS／TV、BV／TV、Tb.N和Tb.Sp 可能是早期檢測(cè)骨小梁結(jié)構(gòu)改變的敏感變量，可預(yù)示骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展［25］。也有研究報(bào)道BMD 檢測(cè)與骨微結(jié)構(gòu)檢測(cè)有一定的相關(guān)性［26］。本研究中對(duì)大鼠股骨及腰椎進(jìn)行了BMD 以及骨微結(jié)構(gòu)檢測(cè)，結(jié)果顯示，維甲酸誘導(dǎo)可降低大鼠股骨、脊椎以及全身骨密度，并且會(huì)導(dǎo)致大鼠股骨及腰椎不同程度的骨量減少。使用復(fù)方牦牛骨粉干預(yù)治療后，大鼠BMD 及骨量丟失狀況有明顯的改善，并且隨劑量增高改善程度增強(qiáng)。同時(shí)骨量丟失的情況，在給藥后也有所好轉(zhuǎn)。

綜上所述，本研究表明，復(fù)方牦牛骨粉可通過增加骨形成、改善骨代謝的途徑防治維甲酸誘導(dǎo)的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥。但是對(duì)于復(fù)方牦牛骨粉改善骨質(zhì)疏松癥的優(yōu)勢(shì)尚不明確。本實(shí)驗(yàn)以期為復(fù)方牦牛骨粉補(bǔ)鈣機(jī)制的進(jìn)一步研究和產(chǎn)品工藝及復(fù)方優(yōu)化提供參考。