李 超 吳 磊 張艷淑Δ

(1華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，唐山 063210；2山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院，濟(jì)南 250062)

紫莖澤蘭(Eupatorium adenophorum spreng)系菊科澤蘭屬多年生半灌木草本植物，是我國首位的外來入侵植物，它侵占農(nóng)田、果園、林地，與農(nóng)作物爭水、爭肥、爭陽光和空間。其可堵塞水渠，阻礙交通，危害畜牧業(yè)，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境生態(tài)的危害性極大。為了防控紫莖澤蘭的傳播蔓延，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，人們對紫莖澤蘭進(jìn)行了開發(fā)利用[1-3]。紫莖澤蘭羥基澤蘭酮(Euptox A)是從紫莖澤蘭中分離出的化合物，具有很好的殺蟲及抑菌效果，可作為一類較好的生物農(nóng)藥資源進(jìn)行開發(fā)利用[4-6]。但是，紫莖澤蘭作為一種有毒雜草，牲畜食用后會導(dǎo)致肝、腎毒性[7]。因此，其對于人類健康的影響也不容忽視。為此，我們對Euptox A進(jìn)行了系統(tǒng)的毒理學(xué)研究[8-10]。本實驗通過研究大鼠靜脈給予Euptox A的毒代動力學(xué)與組織分布，揭示Euptox A在動物體內(nèi)的動態(tài)變化規(guī)律，為紫莖澤蘭的安全利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

1100系列高效液相色譜儀，包括G1311A四元泵、G1379A在線脫氧機(jī)、G1316A柱溫箱、G1315BDAD檢測器和G1313A進(jìn)樣器，美國Agilent公司；AB204-A電子分析天平，梅特勒-托利多上海儀器公司；高速離心機(jī)，美國Thermo Fisher Scientific公司；Euptox A標(biāo)準(zhǔn)品室溫下呈淺黃色固體，不溶于水，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，純度99%。實驗時用注射用大豆油為溶劑，配制后的Euptox A溶液經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾后備用。

1.2 動物分組、處理及樣品采集

健康Wistar雄性大鼠33只，體質(zhì)量240～260g，由山東大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號為：SCXK (魯)2012-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫20.0℃～23.0℃，相對濕度為45%～55%。實驗動物房合格證號：SYXK(魯)2011-0001號。

1.2.1毒代動力學(xué)研究 健康雄性Wistar大鼠15只，隨機(jī)分為3組，每組5只，以尾靜脈給藥的方式，一次性靜脈給予Euptox A 25、50和100mg·kg-1。各組分別于給藥前和給藥后5、10、15、20、30、45、60、90、120、180、270和360min于頸靜脈竇處取血0.25mL，肝素抗凝，1000g離心10min，取血漿，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2組織分布研究 健康雄性Wistar大鼠18只，隨機(jī)分為3組，每組6只，以尾靜脈給藥的方式，一次性靜脈給予Euptox A 50mg·kg-1。分別于靜脈給藥后10、60和120min處死大鼠，迅速取其心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、腸、睪丸和肌肉組織，用生理鹽水將組織樣品沖洗去除殘留物，濾紙吸干，準(zhǔn)確稱量一定的質(zhì)量，加入4倍生理鹽水，制成20%的組織勻漿，1000g離心10min,取上清放置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 生物樣品處理

取100μL血漿或組織樣品加100μL乙腈混勻，8708g離心5min,取上清100μL加400μL流動相稀釋混勻，經(jīng)0.45μL濾膜過濾后進(jìn)樣20μL測定。取空白血漿及組織樣品配成1、5、10、20、40、60、80、100mg·L-1的Euptox A標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，經(jīng)預(yù)處理后記錄色譜圖及峰面積，以Euptox A濃度(X)對峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.4 Euptox A濃度測定

采用1100系列高效液相色譜儀測量生物樣品中Euptox A濃度。色譜柱SB-C18 (250mm×4.6mm,5.0μm)，流動相為甲醇:水=60∶40(v/v)，流速為0.8mL·min-1，進(jìn)樣量20μL，檢測波長為255nm，190～400nm波段全掃描。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 高效液相測定生物樣品Euptox A含量的方法學(xué)確認(rèn)

2.1.1Euptox A全血樣品濃度測定方法確認(rèn) 本實驗前期已按照《化學(xué)藥物非臨床毒代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》完成Euptox A在大鼠全血中含量的方法學(xué)驗證。大鼠全血空白雜質(zhì)對檢測無干擾，Euptox A在2～2000 μg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，Euptox A在20、200、2000 μg·L-1的精密度均<15%，日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度在85%～115%之間，回收率為90.4%～109.1%，符合生物樣品定量測定要求。

2.1.2Euptox A組織樣品中濃度測定方法確認(rèn) Euptox A色譜圖峰形良好，分離完全，心、肝、脾、肺、腎、腦、胃等各組織雜質(zhì)對檢測無干擾，樣品于室溫放置12h及-20℃放置1周穩(wěn)定，精密度均<15%，準(zhǔn)確度在85%～115%之間，回收率為93.8%～104.7%。結(jié)果表明本實驗方法符合生物樣品分析指導(dǎo)原則的要求，具有較高的專屬性。以Euptox A濃度(X)對峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。見表1。

表1 大鼠組織中紫莖澤蘭羥基澤蘭酮(Euptox A)的校正標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)

2.2 Euptox A在大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)

大鼠靜脈給予Euptox A后，Euptox A的毒代動力學(xué)符合線性毒代動力學(xué)特點。大鼠單次靜脈給予Euptox A 25、50和100 mg·kg-1后，5min血藥濃度達(dá)到最高值分別為(2.57±0.60)、(5.83±0.94)和(10.72±2.08)mg·L-1，60min血藥濃度已降至峰濃度的1/10～1/5；消除半衰期分別為(27.4±6.7)、(21.6±5.4)和(18.3±5.8)min；AUC分別為(2039.4±835.3)、(4277.2±1194.6)和(7842.7±1077.8)mg·min-1·L-1；清除率無明顯差異，表明在給藥范圍內(nèi)無消除飽和現(xiàn)象。見圖1、表2。

圖1 大鼠靜脈給予Euptox A后的血藥濃度-時間曲線

表2 大鼠靜脈給予Euptox A的主要毒代動力學(xué)參數(shù)

2.3 Euptox A在大鼠組織中的分布

大鼠靜脈給予Euptox A 50mg·kg-1后，在血液、心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、睪丸和肌肉組織中均有分布，以血液、肝和心較高，給藥后10min達(dá)到最高值，60min后顯著下降， Euptox A在大鼠各組織分布后，消除也較快，給藥后120min各組織中的含量僅為給藥后10min的1/15～1/7，說明Euptox A不會在組織中蓄積。見表3。

表3 大鼠靜脈給予Euptox A 50mg·kg-1各組織中的分布

3 討論

紫莖澤蘭作為具有毒性的一類外來入侵植物，大面積及高密度是其入侵過程中最為顯著的特征。隨著其研究深入，發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭葉片提取物Euptox A在抑菌及殺蟲中具有較好的作用。但是，其可導(dǎo)致動物肝臟損傷[11]。目前，還未見對Euptox A相關(guān)毒代動力學(xué)及組織分布的研究。

本文結(jié)果顯示，Euptox A最大血藥濃度與給藥劑量呈良好的線性關(guān)系，平均消除半衰期最長約30 min，清除率為0.24～0.39 L·min-1·kg-1。提示，在本研究劑量范圍內(nèi)，Euptox A在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化較快，具有吸收快及清除快的特點。在大鼠靜脈給予Euptox A 50 mg·kg-1后，Euptox A在所測定的各組織中均有分布，給藥10 min后各組織中的含量達(dá)最高，然后逐漸下降，120 min后大部分組織含量降至較低。Euptox A在大鼠腦和睪丸中均可測出，說明Euptox A通過血腦屏障和血睪屏障，可能與其相對分子量較小有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭草粉對小鼠睪丸精母細(xì)胞染色體畸變率未見明顯影響，這可能由于紫莖澤蘭相關(guān)提取物在睪丸中濃度較低，且消除較快，以上特征與本研究中Euptox A相似。Euptox A在血漿中含量較高，謝鵬等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Euptox A可誘發(fā)小鼠血液感染性損傷。同時我們發(fā)現(xiàn)心臟和肝臟中Euptox A含量較高，這可能由于該組織器官血流豐富。葉妍琳等[13]發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭中毒馬匹的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)苷酶、堿性磷酸水平顯著升高，而肌酐水平下降，紫莖澤蘭中毒會對馬的肝臟以及腎臟功能產(chǎn)生損傷；董強(qiáng)等[14]同樣發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭全草對小鼠肝臟、腎臟有中等毒性，但以上研究均未證實紫莖澤蘭中何種物質(zhì)可造成肝臟損傷?；谝陨涎芯浚覀冋n題組進(jìn)一步通過亞慢性毒性實驗發(fā)現(xiàn)，Euptox A對小鼠肝臟有較強(qiáng)的毒性作用。

通過研究Euptox A在大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)和組織分布特征，揭示其代謝規(guī)律及分布特征，為Euptox A的進(jìn)一步開發(fā)利用提供毒性評價相關(guān)的科學(xué)依據(jù)。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。