周采菊 高紅剛 郭永恩△ 李愛華 劉 帥 王保國△

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；2日照市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測研究院，日照 276826;3濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)寧 272013)

中藥材藤黃主要活性成分藤黃酸(GA)具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗菌及殺蟲等生物活性[1]；新藤黃酸(GNA)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株有抑制作用[2-3]，且可加強(qiáng)化療藥物對(duì)某些腫瘤細(xì)胞敏感性[4]。它們均能選擇性地攻擊癌細(xì)胞而對(duì)正常造血系統(tǒng)和白細(xì)胞影響較小，但水溶性差 (1L水僅能溶解13mg GA)。目前GA、GNA的較高毒性、低水溶性、較差選擇性、短半衰期等非成藥性，限制了它們?cè)诳拱╊I(lǐng)域的應(yīng)用[5-6]。本實(shí)驗(yàn)通過從藤黃中提取分離GA和有創(chuàng)新性地從殘余物中干柱逆流梯度層析法分離GNA，制備了N-(3-氯-4-氟苯基)藤黃酰胺、N-(3-氯-4-氟苯基)新藤黃酰胺和N-[2-(N’,N’-二甲氨基)乙基]藤黃酰胺3種新分子實(shí)體以求能改善它們的成藥性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

2-(N’,N’-二甲氨基)乙胺購自阿拉丁公司；N,N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)購自北京偶合科技有限公司；3-氯-4-氟苯胺購自AccelaChemBio.Co.Ltd；對(duì)二甲氨基吡啶(DMAP)購自武漢遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技有限公司；石油醚(b.p.60℃～90℃)購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；薄層層析硅膠H、硅膠GF254均購自青島海洋化工有限公司；藤黃購自安徽亳州藥材市場；硅膠GF254薄層板由本課題組鋪制。

1.2 方法

1.2.1GA提取分離[7]取10g藤黃粉末用丙酮(30mL)超聲提取18min傾出上清液,殘?jiān)尤氡?25mL)重復(fù)以上操作。至第4次提取后取少量丙酮溶解痕量殘?jiān)?，與GA、GNA對(duì)照品溶液同板共薄層檢測(TLC,展開劑石油醚-乙醇-三乙胺-乙酸乙酯v/v 1.2∶0.5∶0.2∶0.3)無GA、GNA斑點(diǎn)。其它同胡鐘操作[7]得純GA固體，ESIMS m/z 651[M+Na+]，可直接用于本文下述反應(yīng)。

1.2.2GNA的分離 1)制備含GA、GNA粗品的硅膠拌樣。濾除GA吡啶鹽沉淀，主要含GA、GNA粗品的母液，制備同胡鐘操作[7]。減壓蒸除吡啶后的2.0g殘余物0.5%鹽酸調(diào)pH 3～4后乙酸乙酯提取(9mL×4)，至水層與GA、GNA對(duì)照品同板共薄層檢測(展開劑石油醚-乙醇-三乙胺-乙酸乙酯v/v 1.2∶0.5∶0.2∶0.3)無GA、GNA斑點(diǎn)。合并提取液水洗(3mL×3) 分出有機(jī)層無水硫酸鎂干燥1h，濾液減壓濃縮后所得殘余物溶于盡可能少的丙酮并加盡可能少的200目硅膠使沒過液面，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸除溶劑得粗品硅膠拌樣(含60%左右的GA、GNA粗品)用于GNA的分離。

2)逆流干柱層析法從以上硅膠拌樣中分離高純度的GNA[8]。①裝柱。如專利文獻(xiàn)[8]所示，底端不帶活塞、上端非磨口的帶透砂板的層析柱中依次填充適量以上拌樣粗硅膠、硅膠H[硅膠高度∶內(nèi)徑>8∶1，硅膠H與待分離樣品重量比 (80～120)∶1]后，關(guān)閉洗脫劑裝置部分的底部活塞并水泵抽實(shí)。②柱層析。關(guān)閉抽氣部分、適度打開裝洗脫劑分液漏斗的底部活塞，依次以適量體積的石油醚-乙醇-三乙胺-乙酸乙酯 v/v 6∶2∶1∶1.5體系和石油醚-乙醇-三乙胺-乙酸乙酯 v/v 4∶2∶1∶2體系梯度洗脫，按洗脫劑前沿1～3cm/min高度的上升速度開始干柱逆流柱層析直至洗脫劑前沿跑過硅膠H最上端、原拌樣中樣品在硅膠H柱上分出數(shù)條色帶。③樣品處理。取下色譜柱并底端連接打氣筒小心把硅膠吹出到干凈托盤中，把與薄層層析中GNA對(duì)應(yīng)的譜帶均勻分成3～5段，且每段取樣TLC(展開劑石油醚-乙醇-三乙胺-乙酸乙酯v/v 1.2∶0.6∶0.2∶0.1)法檢測其中GNA的純度。分別合并以上含GNA純品、較純品的硅膠H，95%乙醇洗脫各段硅膠中的GNA至完全，洗脫液合并濃縮、稱重后HPLC法檢測純度93%,ESI-MSm/z 631[M+H+]。

1.2.3GA和GNA酸酰胺新實(shí)體的制備[9-10]1)N-(3-氯-4-氟苯基)藤黃酰胺的合成。25mL圓底燒瓶中依次取0.6mL 5.0mmol/L的GA二氯甲烷溶液(含3.0μmol GA)、0.72mL 5.0mmol/L的DIC二氯甲烷溶液(含3.6μmol DIC) 和0.6mL 1.0mmol/L的DMAP二氯甲烷溶液(含0.6μmol DMAP) 室溫?cái)嚢?5min后，加入0.66mL 5.0mmol/L 3-氯-4-氟苯胺二氯甲烷溶液(含3.3μmol 3-氯-4-氟苯胺)。室溫繼續(xù)攪拌10h，至TLC(展開劑石油醚-乙醇-三乙胺v/v 4.5∶1∶1)檢測反應(yīng)液中GA斑點(diǎn)消失。加水淬滅反應(yīng)后分出有機(jī)層，依次水洗(3mL)、1%鹽酸 (2mL)、水洗(3mL)后分出有機(jī)相無水硫酸鎂干燥。濾除干燥劑濾液減壓濃縮后，粗產(chǎn)物經(jīng)干法上樣、石油醚-乙醇-三乙胺-乙酸乙酯v/v 8∶1.2∶1∶1作洗脫劑的硅膠H干柱層析即得N-(3-氯-4-氟苯基)藤黃酰胺樣品。ESI MS m/z 756[M+];1H NMR(CDCl3，400MHz)δ:12.70(s,1H,6-OH),8.01(s,1H,NH),7.56(d,J=7.1Hz,1H,10-H),7.30～7.46(m,3H,Ph-H),6.77～6.83 (m,1H,27-H),6.62(d,J=12Hz,1H,4-H),5.01～5.08(m,1H,37-H),3.46～3.51(m,1H,11-H),3.27～3.36(m,1H,31a-H),3.16～3.24(m,1H,31b-H),2.93(d,J=32Hz,2H,26-H),2.66～2.75(m,1H,32-H),2.54(d,J=9.4Hz,1H,22-H),2.28～2.35 (dd,J=13.4,4.7Hz,1H,21a-H),1.98～2.07(m,2H,36-H),1.31～1.81(m,28H)。見圖1。

2)N-(2-N’,N’-二甲氨基)乙基藤黃酰胺的合成。25mL圓底燒瓶中依次取0.6mL 5.0mmol/L的GA二氯甲烷溶液(含3.0μmol GNA)、0.72mL 5.0mmol/L的DIC二氯甲烷溶液(含3.6μmol GNA) 和0.6mL 1.0mmol/L的DMAP二氯甲烷溶液(含0.6μmol DMAP) 室溫?cái)嚢?5min后，加入0.50mL 10.0mmol/L(5.0μmol)N’,N’-二甲基乙二胺(DMEA)的二氯甲烷溶液。室溫繼續(xù)攪拌8h，至TLC(展開劑石油醚-乙酸乙酯v/v 4∶1)檢測反應(yīng)液中GA斑點(diǎn)消失。加水淬滅反應(yīng)后分出有機(jī)層，水洗(2.5mL×2)后分出有機(jī)相無水硫酸鎂干燥。濾除干燥劑濾液減壓濃縮后，粗產(chǎn)物經(jīng)干法上樣、依次石油醚-乙酸乙酯 v/v 10∶1和6∶1作洗脫劑的硅膠H干柱層析即得N-[2-(N’,N’-二甲氨基)乙基]藤黃酰胺樣品ESI MS m/z698 (M+);1H NMR(CDCl3，400MHz) δ:12.70(s,1H,6-OH),8.01(s,1H,NH),7.56(d,J=7.1Hz,1H,10-H),6.77～6.83(m,1H,27-H),6.62(d,J=12 Hz,1H,4-H),5.01～5.08(m,1H,37-H),3.46～3.51(m,1H,11-H),3.27～3.36(m,1H,31a-H),3.16～3.24(m,1H,31b-H),2.93(d,J=32Hz,2H,26-H),2.66～2.75(m,1H,32-H),2.54(d,J=9.4Hz,1H,22-H),2.28～2.35(dd,J=13.4,4.7Hz,1H,21a-H),1.98～2.07(m,2H,36-H),2.40(dd,2H,CH2),2.26(dd,2H,CH2),2.20～2.23(s,6H,2CH3),1.31～1.81(m,28H)。見圖1。

圖1 N-芳基/烷基藤黃酰胺制備反應(yīng)式

3)N-(3-氯-4-氟苯基)新藤黃酰胺的合成。25mL圓底燒瓶中依次取0.6mL 5.0mmol/L的GNA二氯甲烷溶液(含3.0μmol GNA)、0.66mL 5.0mmol/L的DIC二氯甲烷溶液(含3.3μmol DIC)和0.6mL 1.0mmol/L的DMAP二氯甲烷溶液(含0.6μmol DMAP) 室溫?cái)嚢?5min后，加入0.72mL 5.0mmol/L 3-氯-4-氟苯胺二氯甲烷溶液(含3.6μmol 3-氯-4-氟苯胺)。室溫繼續(xù)攪拌11h至TLC(展開劑石油醚-乙醇-三乙胺-乙酸乙酯v/v 4∶1)檢測反應(yīng)液中GNA斑點(diǎn)消失。加水淬滅反應(yīng)后分出有機(jī)層，依次水洗(3mL)、1% 鹽酸(2mL)、水洗(3mL)后分出有機(jī)相無水硫酸鎂干燥。濾除干燥劑濾液減壓濃縮后粗產(chǎn)物經(jīng)干法上樣、依次石油醚-乙酸乙酯 v/v 10∶1和6∶1作洗脫劑的硅膠H干柱層析，即得N-(3-氯-4-氟苯基)新藤黃酰胺樣品。ESI MS m/z758 (M+);1H NMR(CDCl3) δ:12.71(s,1H,6-OH),8.01(s,1H,NH),7.70～7.58(m,3H,Ph-H),7.53(d,J=7.1Hz,1H,10-H),6.43～6.46(m,1H,27-H),5.84(m,1H),5.20(t,1H,J=7.1,7.0Hz,3-H),5.02～5.08(m,1H,37-H),3.49(dd,1H,J=4.6,6.7Hz,11-H),3.17～3.36(m,5H),2.88(dd,1H,J=5.6,15.7Hz),2.48(d,J=9.1Hz,1H),2.30(dd,J=4.6,13.4Hz,1H),1.97～2.15(m,4H),1.31～1.81(m,26H)。見圖2。

圖2 N-芳基新藤黃酰胺制備反應(yīng)式

2 結(jié)果和討論

2.1 硅膠H逆流干柱梯度層析技術(shù)的優(yōu)勢(shì)及洗脫劑的確定

本文使用的硅膠H逆流干柱梯度層析技術(shù)分離層帶窄而整齊、分離度大、可獲得較高柱效，與傳統(tǒng)濕法硅膠柱色譜相比有分離操作簡便、耗時(shí)短、溶劑消耗量小、分離效率高等優(yōu)點(diǎn)。柱層析前用硅膠GF254薄層層析法找出GNA斑點(diǎn)與其它斑點(diǎn)Rf差值較大、成點(diǎn)性好的展開劑，按極性增大順序直接用作硅膠H柱逆流梯度層析中的洗脫劑。

2.2 藤黃粉提取溶劑的確定

從藤黃中提取GA、GNA時(shí)用丙酮代替甲醇作提取溶劑，能降低操作時(shí)的毒性且以上2種有效成分在丙酮中穩(wěn)定性更大。

2.3 藤黃粉和新藤黃酸酰胺的設(shè)計(jì)理念

4-氟-3-氯苯胺和2-(N’,N’-二乙氨基)乙胺，分別是第二代、不可逆的EGFR酪氨酸激酶抑制劑達(dá)克替尼、可口服的多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑蘇尼替尼中的結(jié)構(gòu)片段。GA、GNA結(jié)構(gòu)中引入4-氟-3-氯苯胺和結(jié)構(gòu)相似的2-(N’,N’-二甲氨基)乙胺，可能降低毒性并提高抗腫瘤活性，且引入2-(N’,N’-二乙氨基)乙胺片段還可能改善它們的水溶性，均可改善其成藥性。

2.4 藤黃酰胺類制備中縮合試劑的選擇

酰胺類的藥物合成方法按上述操作N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)與1-羥基苯并三唑(HOBt)聯(lián)合催化GA、GNA與脂肪胺的酰胺化，但與芳胺酰胺化時(shí)只得到中間產(chǎn)物活性酯。后改用DIC與DMAP按本文操作聯(lián)合催化酰胺化，才成功得到N-芳基取代的藤黃酰胺和新藤黃酰胺。

以上GA、藤黃酰胺制備均以mmol/L濃度、μmol/L級(jí)的量進(jìn)行。如其它條件不變而使用高濃度的相應(yīng)試劑進(jìn)行上述操作，反應(yīng)速度則會(huì)增大。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。