潘會君，朱聰聰，張歡歡，朱全剛，4

(1.上海市皮膚病醫(yī)院，上海 200443；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州450046；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008；4.同濟(jì)大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院，上海 200443)

重樓ParidisRhizoma為百合科植物云南重樓Paris poly phylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.－Mazz.或七葉一枝花Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根莖，有清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚的功效，常用于疔瘡癰腫，咽喉腫痛，蛇蟲咬傷，跌撲傷痛，驚風(fēng)抽搐等.重樓是重要的中藥材資源，近年來重樓的抗腫瘤、抗氧化、抗菌等藥理作用逐漸受到關(guān)注[1－2]，重樓皂苷的抗腫瘤作用被廣泛報道，重樓皂苷能明細(xì)抑制乳腺癌細(xì)胞4T1增殖，遷移[3]，其中重樓皂苷Ⅰ的抗腫瘤作用研究報道較多.重樓皂苷I的抗腫瘤作用與細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)自噬、抗血管生成、使腫瘤對化療敏感、參與炎癥和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)相關(guān)[4].

黑色素瘤是一種來源于轉(zhuǎn)化黑素細(xì)胞的惡性腫瘤，發(fā)病率在全球范圍內(nèi)持續(xù)上升[5].黑色素瘤的致命性更強(qiáng)，約占皮膚癌相關(guān)死亡病例的73%[6]，對常規(guī)的放化療敏感性低，生物靶向藥物會產(chǎn)生快速耐藥使得黑色素瘤的預(yù)后未得到有效改善，患者平均生存期只有6～9個月[7].黑色素瘤尤其是轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療目前仍沒有很好的治療手段，因此藥物研發(fā)仍是轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療的關(guān)鍵.

研究顯示，重樓皂苷I能抑制人黑色素瘤細(xì)胞A2058、G361的增殖并能誘導(dǎo)其凋亡[8].然而重樓皂苷I對黑色素瘤的作用機(jī)制尚未完全闡明，因此本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合，從系統(tǒng)藥理學(xué)角度探究重樓皂苷Ⅰ對黑色素瘤的作用及潛在機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1.1 靶點(diǎn)收集

從Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，Coreminemecical(https://coremine.com/medical/)數(shù)據(jù)庫檢索重樓皂苷I的分子靶點(diǎn).所有靶點(diǎn)統(tǒng)一在UniProt(https://www.uniprot.org/)上校正，轉(zhuǎn)換成Homo sapiens的Official Gene Symbol.

1.1.2 黑色素瘤靶點(diǎn)的獲取

以“melanoma”為檢索詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中進(jìn)行檢索，對獲取的結(jié)果進(jìn)行整合、收集蛋白編碼的靶點(diǎn).所有靶點(diǎn)統(tǒng)一在UniProt上校正，轉(zhuǎn)換成Homo sapiens的Official Gene Symbol.

1.1.3 交集靶點(diǎn)及蛋白－蛋白相互作用(proteinprotein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將重樓皂苷I的作用靶點(diǎn)，黑色素瘤的靶點(diǎn)分別輸入在線Venn分析工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，并繪制Venn圖，獲得藥物與疾病的共有靶點(diǎn).將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING Version 11.0(https://string－db.org/)[9]，構(gòu)建蛋白互作關(guān)系，并導(dǎo)出互作關(guān)系，格式為后綴名tsv的文件，將文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)網(wǎng)絡(luò).本研究采用最高等置信度(0.9)的相互作用關(guān)系.

1.1.4 核心靶點(diǎn)識別

利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)后，使用Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)湫再|(zhì)參數(shù).網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)湫再|(zhì)參數(shù)，包括度、介數(shù)中心度及接近中心性[10].研究認(rèn)為，一個點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)度(degree)為該網(wǎng)絡(luò)度中位數(shù)的2倍或以上則定義為核心成分和靶點(diǎn)[11].

1.1.5 基因本體(GO)及京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析

利用 DAVID v6.8(https://david.ncifcrf.gov/)[12]在線分析工具對蛋白模塊進(jìn)行GO(Gene ontology)分析及KEGG通路富集.使用基迪奧生物信息繪圖云平臺(https://www.omicshare.com/tools/)對富集結(jié)果進(jìn)行氣泡圖繪制.

1.1.6 構(gòu)建KEGG網(wǎng)絡(luò)

使用基迪奧生物信息繪圖云平臺的“kegg網(wǎng)絡(luò)圖”工具構(gòu)建通路圖網(wǎng)絡(luò)，然后采用利用Cytoscape 3.7.2軟件重建KEGG網(wǎng)絡(luò)，使用Network Analyzer插件分析通路的拓?fù)湫再|(zhì)參數(shù).

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 儀器

Heal Force HF151UV CO2培養(yǎng)箱，Heal Force HPsafe－1200LC生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；低溫高速離心機(jī)(Thermo scientific)；Spectra-Max M2酶標(biāo)儀(美谷分子儀器(上海)有限公司)；倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS IX53).

1.2.2 試劑

重樓皂苷I購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司，純度≥98%，批號:19091931)；CCK－8試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，編號C0038；Annexin V－FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，編號C1062L；DMEM，胰蛋白酶，胎牛血清購自Gibco公司.

1.2.3 細(xì)胞株

A375細(xì)胞，購自復(fù)蒙基因生物科技有限公司，來源人，組織來源皮膚惡性黑色素瘤，形態(tài)上皮樣.

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)

A375細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)培養(yǎng)，置37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.5 CCK－8法

收集對數(shù)期細(xì)胞，接種細(xì)胞于96孔板，每孔加入100μL約5000個細(xì)胞.37℃，5%CO2培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁24 h，加入重樓皂苷I，5%CO2，37℃培養(yǎng)24 h，每孔加入10μL CCK－8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，酶標(biāo)儀450 nm處測量各孔的吸光值(OD值).細(xì)胞活力(%)＝[(用藥組OD值－空白組OD值)/(對照組OD值－空白組OD值)]×100%.

1.2.6 細(xì)胞形態(tài)觀察

收集對數(shù)期細(xì)胞，接種細(xì)胞于96孔板，37℃，5%CO2培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁24 h，加入重樓皂苷I孵育24 h.倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài).

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞

取對數(shù)生長期A375細(xì)胞，按5×104/mL接種于6孔板中，每孔加細(xì)胞懸液2 mL，培養(yǎng)24 h，加入不同濃度重樓皂苷I孵育24 h，收集細(xì)胞，1000 r/min離心，棄上清液，PBS洗滌，收集細(xì)胞，在冰浴中避光進(jìn)行如下操作:用試劑盒中結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞為5×104/mL，加入Annexin－FITC和PI染色液，混勻后孵育15 min，于1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡.

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，多組計量資料采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK法檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 重樓皂苷I靶點(diǎn)

重樓皂苷I是重樓的皂苷成分之一，其結(jié)構(gòu)式見圖1.通過Pubchem，Coreminemecical數(shù)據(jù)庫檢索整理重樓皂苷Ⅰ的靶點(diǎn)，其中Pubchem獲得81個靶點(diǎn)，Coreminemecical獲得86個靶點(diǎn)，經(jīng)合并去重獲得117個靶點(diǎn).

圖1 重樓皂苷Ⅰ分子式Fig.1 Molecular formula of polyphyllin I

2.2 黑色素瘤靶點(diǎn)的獲取

以“melanoma”為關(guān)鍵詞檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫.通過GeneCards數(shù)據(jù)庫收集黑色素瘤蛋白編碼靶點(diǎn)，獲得5321個靶點(diǎn).

2.3 潛在作用靶點(diǎn)

重樓皂苷I的靶點(diǎn)和黑色素瘤的靶點(diǎn)，共有104個交集，這些共同靶點(diǎn)為重樓皂苷I治療黑色素瘤的潛在作用靶點(diǎn)(圖2).

圖2 重樓皂苷I治療黑色素瘤的潛在作用靶點(diǎn)Fig.2 Potential therapeutic targets of polyphyllin I in melanoma

2.4 潛在作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)

將獲得的104個潛在作用靶點(diǎn)輸入蛋白交互網(wǎng)站STRING進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并將其結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化，結(jié)果見圖3.PPI網(wǎng)絡(luò)中共有96個節(jié)點(diǎn)(去除8個獨(dú)立節(jié)點(diǎn))，507條邊，節(jié)點(diǎn)大小和節(jié)點(diǎn)顏色根據(jù)degree值排序，degree值越大節(jié)點(diǎn)越大且顏色越深.

圖3 重樓皂苷I治療黑色素瘤的潛在作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network as a potential therapeutic targets of polyphyllin I in melanoma

通過Network Analysis分析，靶點(diǎn)的Degree的中位數(shù)8.5，大于中位數(shù)2倍的靶點(diǎn)有20個，分別為TP53，AKT1，STAT3，MAPK8，MAPK14，JUN，MAPK3，MAPK1，CTNNB1，MYC，RELA，PIK3CA，NFKB1，CCND1，EGFR，VEGFA，TNF，F(xiàn)OS，RB1，IL6，以上靶點(diǎn)為重樓皂苷Ⅰ治療黑色素瘤的核心靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)與黑色素瘤的生長、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(表1).

表1 核心靶點(diǎn)的Degree值Table 1 Degree value of the core target

2.5 GO富集分析

對104個潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，根據(jù)P<0.01，生物過程(Biological process，BP)富集251條、細(xì)胞組分(Cellcomponent，CC)富集27條和分子功能(Molecularfunction，MF)富集40條.將基因GO本體條目按P從小到大排序后選取前20繪制BP、CC和MF的柱狀圖.

BP主要涉及負(fù)調(diào)控細(xì)胞凋亡、正調(diào)控基因表達(dá)、藥物反應(yīng)、正調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、肽絲氨酸磷酸化、細(xì)胞增殖調(diào)控、激活MAPK等，見圖4.

圖4 重樓皂苷Ⅰ潛在作用靶點(diǎn)參與的生物過程Fig.4 Biological processes involved in potential targets of polyphyllin I

CC主要涉及核質(zhì)、胞質(zhì)溶膠、線粒體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、蛋白質(zhì)復(fù)合體、核染色質(zhì)、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物、線粒體外膜、細(xì)胞表面等，見圖5.

圖5 重樓皂苷Ⅰ潛在作用靶點(diǎn)涉及的細(xì)胞組成Fig.5 Cell components involved in potential targets of polyphyllinI

MF主要涉及蛋白結(jié)合、MAP激酶活性、蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、酶結(jié)合、激酶活性、染色質(zhì)結(jié)合等，見圖6.

圖6 重樓皂苷Ⅰ潛在作用靶點(diǎn)參與的分子功能Fig.6 Molecular functions involved in potential targets of polyphyllinI

2.6 KEGG通路富集

對104個潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集，根據(jù)P<0.01得到96條KEGG通路.涉及癌癥，如癌癥通路、癌癥中的蛋白多糖等；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，如FOXO信號通路、TNF信號通路、PI3K－Akt信號通路；免疫系統(tǒng)，如Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等.將KEGG通路按P<0.01從小到大進(jìn)行排序后選取前20排名的通路繪制氣泡圖，見圖7.從KEGG通路富集結(jié)果分析，重樓皂苷I與癌癥通路密切相關(guān)，并且也富集到黑色素瘤通路，見圖8.

圖7 重樓皂苷Ⅰ潛在靶點(diǎn)富集的KEGG通路Fig.7 KEGG pathways involved in potential targets of polyphyllin I

2.7 KEGG通路網(wǎng)絡(luò)圖

為了理解KEGG通路之間的關(guān)系，對富集到的96條KEGG通路進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并進(jìn)行通路的拓?fù)湫再|(zhì)分析，其中MAPK信號通路，PI3K－Akt通路，凋亡，細(xì)胞周期，p53信號通路，Jak－STAT信號通路，TOLL樣受體信號通路，mTOR信號通路，NF－kappa B信號通路，癌癥通路連接度較高，關(guān)系密切，發(fā)揮著重要調(diào)控作用；其中黑色素瘤與MAPK信號通路，PI3K－Akt通路，細(xì)胞周期，p53信號通路關(guān)系最為密切，見圖8和表2.

表2 KEGG通路網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鯰able 2 Topological analysis of KEGG pathways network

Pathways in cancer 4614 Human Diseases Cancers Viral carcinogenesis 2013 Human Diseases Cancers Wnt signaling pathway 1213 Environmental Information Processing Signal transduction Focal adhesion 1712 Cellular Processes Cellular community Hepatitis B 3511 Human Diseases Infectious diseases Epstein－Barr virus infection 2410 Human Diseases Infectious diseases T cell receptor signaling pathway 1910 Organismal Systems Immune system RIG－I－like receptor signaling pathway 1410 Organismal Systems Immune system ErbB signaling pathway 1410 Environmental Information Processing Signal transduction VEGF signaling pathway 1110 Environmental Information Processing Signal transduction Insulin signaling pathway 1310 Organismal Systems Endocrine system

圖8 重樓皂苷I的KEGG通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.8 KEGG pathways network of polyphyllin I

2.8 重樓皂苷I對黑色素瘤A375細(xì)胞增殖的影響

重樓皂苷I不同濃度處理A375細(xì)胞24 h，隨著濃度的增加細(xì)胞活力逐漸下降，且呈劑量依賴性，見圖9.

圖9 重樓皂苷I對黑色素瘤A375細(xì)胞增殖的影響Fig.9 Effects of polyphyllin I on the proliferation of A375 cells

2.9 重樓皂苷I對黑色素瘤A375細(xì)胞形態(tài)的影響

重樓皂苷I作用于A375細(xì)胞24 h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，隨著重樓皂苷I濃度的加大，細(xì)胞體積縮小變圓，細(xì)胞減少，見圖10.

圖10 重樓皂苷I對黑色素瘤A375細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.10 Effects of polyphyllin I on morphology of A375 cells

2.10 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

AnnexinV/PI雙 染 法結(jié) 果 顯 示，0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L重樓皂苷I促進(jìn)A375細(xì)胞凋亡，隨著重樓皂苷I劑量的增大A375細(xì)胞凋亡明顯增多，見圖11.

圖11 重樓皂苷I對黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡的影響Fig.11 Effects of polyphyllin I on apoptosis of A375 cells

3 討論

重樓皂苷I對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，但對于黑色素瘤的研究較少.本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基礎(chǔ)系統(tǒng)分析重樓皂苷I治療黑色素瘤的特征分子機(jī)制，結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，揭示重樓皂苷I治療黑色素瘤的潛在分子靶點(diǎn)及信號通路.

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)重樓皂苷I的分子靶點(diǎn)與黑色素瘤靶點(diǎn)有104個重合，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)TP53，AKT1，STAT3，MAPK8，MAPK14，JUN，MAPK3，MAPK1，CTNNB1，MYC，RELA，PIK3CA，NFKB1，CCND1，EGFR，VEGFA，TNF，F(xiàn)OS，RB1，IL6為重樓皂苷I治療黑色素瘤的核心靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)與黑色素瘤的生長、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān).

生物過程富集發(fā)現(xiàn)重樓皂苷I具有調(diào)控細(xì)胞凋亡、調(diào)控基因表達(dá)、藥物反應(yīng)、正調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、肽絲氨酸磷酸化、細(xì)胞增殖調(diào)控、激活MAPK等；分子功能涉及蛋白結(jié)合、MAP激酶活性、蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、酶結(jié)合、激酶活性、染色質(zhì)結(jié)合等；KEGG通路涉及癌癥通路、FOXO信號通路、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路、NOD樣受體信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等.進(jìn)一步的KEGG通路網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，MAPK信號通路，PI3K－Akt通路，凋亡，細(xì)胞周期，p53信號通路，Jak－STAT信號通路，TOLL樣受體信號通路，mTOR信號通路，NF－kappa B信號通路，癌癥通路連接度較高，表明這些通路關(guān)系密切；其中黑色素瘤通路與MAPK信號通路，PI3K－Akt通路，細(xì)胞周期，p53信號通路關(guān)系最為密切.

我們的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示重樓皂苷I能抑制A375細(xì)胞的增殖，并且能促進(jìn)其凋亡.Long J等[13]的研究表明重樓皂苷I具有抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖，并能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，調(diào)控細(xì)胞周期，并且促進(jìn)細(xì)胞自噬，對p－PI3K，p－AKT，and p－mTOR有明細(xì)抑制作用.Long J等重樓皂苷I促進(jìn)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與我們的一致.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示重樓皂苷促進(jìn)細(xì)胞凋亡，調(diào)控細(xì)胞周期及自噬.

進(jìn)一步對重樓皂苷I抗腫瘤的文獻(xiàn)進(jìn)行回顧，我們發(fā)現(xiàn)重樓皂苷I通過STAT3/HOTAIR信號通路抑制EZH2誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡[14]；部分通過激活FOXO3信號傳導(dǎo)途徑對膀胱癌發(fā)揮抗腫瘤活性[15]；通過觸發(fā)G2/M細(xì)胞周期阻滯來抑制HepG2細(xì)胞增殖和生長，并通過細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而通過產(chǎn)生活性氧而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16]；直接AMPK激活劑的作用，調(diào)節(jié)HOTAIR和c－Jun表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而抑制非小細(xì)胞肺癌NSCLC細(xì)胞的生長[17－18]；誘導(dǎo)急性白血病THP－1和NB4細(xì)胞凋亡及自噬，并且與激活JNK信號通路有關(guān)[19].因此，重樓皂苷I具有廣泛的抗腫瘤作用，其作用與細(xì)胞凋亡，細(xì)胞自噬，細(xì)胞周期等密切相關(guān)，其抗腫瘤機(jī)制與PI3K－Akt通路，Jak－STAT信號通路，F(xiàn)OXO3信號通路有關(guān).

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)提示重樓皂苷I對黑色素瘤的作用是干預(yù)多條信號通路的結(jié)果，其中PI3K－Akt通路已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)得到了驗(yàn)證.重樓皂苷I影響其他信號通路從而發(fā)揮治療黑色素瘤的作用為下一步研究提供了依據(jù).