王思淵，張國林綜述，邢以文，楊純審校

1.蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215000；2.蘇州大學附屬兒童醫(yī)院 兒科病研究所，江蘇 蘇州 215000

單克隆抗體類藥物（以下簡稱單抗類藥物）是一類以免疫球蛋白G（IgG）結構為基礎，由對稱的2條重鏈及2條輕鏈可變區(qū)組成抗原結合結構域，可識別相應特異抗原的大分子蛋白類藥物［1］。隨著生物技術的發(fā)展，單抗類藥物制備技術日益完善，該類藥物在整個醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)的地位顯得日趨重要，越來越多的醫(yī)藥公司，尤其是國際性大公司，均在積極開展單抗類藥物的研發(fā)和生產［2-3］。目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food&Drug Administration，F(xiàn)DA）批準上市的單抗類藥物已有60余種，另有超過300種處于臨床試驗階段，主要應用于腫瘤、自身免疫病、心血管疾病及感染性疾病等多種疾病的治療［4-7］。國內大型醫(yī)藥企業(yè)在單抗類藥物的研發(fā)能力和生產產能正處于迅速提升中，其中以上海君實生物醫(yī)藥科技股份有限公司旗下的蘇州眾合生物醫(yī)藥科技有限公司、信達生物制藥（蘇州）有限公司、蘇州盛迪亞生物醫(yī)藥有限公司和百濟神州生物科技有限公司尤為突出。除了已上市的阿達木單抗、貝伐單抗、曲妥珠單抗及多款PD-1／PD-L1單抗類藥物外，以抗體藥物偶聯(lián)（antibody-drug conjugate，ADC）、雙特異性抗體（bispecific antibody）、免疫檢查點抗體（immune checkpoint inhibitor）為代表的新型單抗類藥物也是目前國內外生物制藥公司研究的熱點［8-12］。單抗類藥物生產工藝及過程有別于傳統(tǒng)化學藥品，含有一些傳統(tǒng)工藝中沒有的雜質，存在一定質量風險，因此其質量控制要點及相應的檢測方法與傳統(tǒng)化學藥品有較大差異。單抗類藥物質量控制，尤其是雜質分析具有復雜性和多樣性，有別于小分子藥物，需通過多個維度對其分子進行表征分析才能確保其有效性、安全性和一致性［13］。因此，本文著重就單抗類藥物常用的質量標準相關規(guī)定、雜質控制要點及相應分析方法作一綜述，以期為該類藥物的生產研發(fā)企業(yè)及相關檢定單位提供參考。

1 單抗類藥物質量標準的相關規(guī)定

目前，單抗類藥物質量標準相關規(guī)定主要參照《中國藥典》三部（2015版）［14］、《中國藥典》四部（2015版）［15］通則、WHO相關定義與要求、人用藥物注冊技術要求國際協(xié)調會議（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH）對生物技術產品、生物制品及生物類似藥的相關規(guī)定［16-17］、FDA和《美國藥典》的相關技術指南［18］、歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）相關技術規(guī)范制定［19］。由于單抗類藥物是新型藥物，自2018年以來，雖國內已有多家企業(yè)陸續(xù)上市多個單抗類藥物，但未被《中國藥典》收載，均參照上述法規(guī)及指導原則執(zhí)行各自注冊標準。

2 單抗類藥物的檢定

2.1 性狀與理化性質檢定 單抗類藥物是經細胞表達、純化，制劑工藝后獲得的。不同的制劑工藝、配方、存儲及運輸條件均會影響其分子間及分子內部共價鍵和非共價鍵的形成或打開，從而改變單抗類藥物的性狀與理化性質［20］。因此，單抗類藥物的性狀與理化性質檢定是其質量控制的必要環(huán)節(jié)，檢定項目主要包括外觀、復溶時間、裝量差異、pH、可見異物、澄清度、不溶性微粒、摩爾滲透壓、水分等［21］。目前，單抗類藥物的性狀與理化性質檢定標準多參照《中國藥典》三部（2015版）［14］及《中國藥典》四部（2015版）［15］通則制定。

2.2 雜質的控制要點及相應分析技術

2.2.1 基于毛細管電泳技術（capillaryelectrophoresis，CE）的純度和雜質分析 《中國藥典》四部（2015版）［15］通則0542表明，CE是一類以彈性石英毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力，根據分子電荷和分子質量大小不同實現(xiàn)分離的新型分離技術，是電泳與色譜結合的產物。單抗類藥物是電荷異質性和分子質量相近的異種混合物，在產品生產及批放行過程均需確保其純度及完整性，且無不需要的修飾發(fā)生。CE由于具有快速、靈敏、可靠等優(yōu)勢，已成為單抗類藥物純度和雜質分析中的必備技術［22-24］。在CE的多種分離模式中，依靠等電點分離的毛細管等電聚焦成像電泳（imaged capillary isoelectric focusing，iCIEF）、依靠電荷／質量比分離的毛細管區(qū)帶電泳（capillary zone electrophoresis，CZE）和依靠相對分子質量大小分離的毛細管凝膠電泳（capillary gel electrophoresis，CGE）是單抗類藥純度和雜質分析中最常用的3種模式。

單抗類藥物分子的修飾，如糖基的唾液酸化、谷氨酸環(huán)化、二硫鍵的氧化等均會影響抗體的電荷異質性及等電點［25］。iCIEF中電解質溶液形成pH梯度，各組分遷移至各自等電點時變?yōu)橹行孕纬蓷l帶，給出蛋白質電荷異質性分布的信息。iCJEF在單抗類藥物純度和雜質分析中主要用于等電點的鑒定與電荷異質性的檢查。與傳統(tǒng)平板凝膠電泳比較，iCIEF具有耗時短、樣品用量少、分辨率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。2017年，GOYON等［26］用iCIEF測定了23種治療性單抗的等電點，發(fā)現(xiàn)實驗檢測值與等電點計算理論值的相關性較好。

CZE中各組分根據各自的電泳流和電滲流按陽離子（酸性峰）、中性粒子（主峰）和陰離子（堿性峰）的順序通過檢測器。CZE在單抗類藥物純度和雜質分析中主要用于電荷異質性的檢查。與iCIEF法比較，CZE用于電荷異質性分析更快速［27］。同時，由于CZE所用緩沖液的紫外吸收低，可采用214 nm波長紫外檢測，比采用280 nm檢測的iCIEF具有更高的靈敏度［28］。CZE用于電荷異質性分析的另一個優(yōu)勢在于其易于與質譜檢測器連接，可為電荷變異體的結構分析鑒定提供重要信息［29-30］。

目前，應用于單抗類藥物還原和非還原性純度分析（大小異質性）和N寡糖分析的CGE，由于樣品蛋白質與十二烷基硫酸鈉（SDS）結合形成復合物，這種模式也被稱為SDS無膠篩分毛細管電泳（capillary electrophoresis-SDS，CE-SDS）。與SDS-PAGE比較，CESDS更快捷，耐用性更好，精密度及分辨率更高，且無拖尾峰、樣品殘留少、線性和重復性較高［31］。由于CE-SDS檢測無需對結果進行二次處理，其結果較SDS-PAGE更準確、穩(wěn)定、客觀，且CE-SDS法能將非糖基化重鏈與重鏈分離后對非糖基化重鏈進行定量分析［32］。目前，CE-SDS主要采用紫外檢測和激光誘導熒光檢測兩種檢測方法。GUO等［33］報道，利用激光誘導熒光檢測器檢測痕量雜質的靈敏度更高。

近年，CE法開始涉及探索單抗類藥物糖基分析領域，通過N糖苷酶F對單抗N糖進行酶切，再對酶切的N糖進行標記衍生，采用毛細管電泳結合激光誘導熒光檢測器（capillary electrophoresis-laser induced fluorescence，CE-LIF）進行測定。與經典液相技術分析方法比較，CE-LIF的N糖標記前處理僅需1h，具有分析快速簡便的優(yōu)勢［34］。同時，SHEN等［35］報道，可采用毛細管凝膠電泳結合激光誘導熒光檢測器（capillary gel electrophoresis-laser induced fluorescence，CGE-LIF）技術分析宿主細胞殘留DNA（host cell DNA，HCD）的分布。該方法的檢測靈敏度明顯高于ELISA法，其檢測限低至6.25 ng／μL，定量限低至25 ng／μL。CE-LIF對酶切產物分離度高，在傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠法有7個條帶的情況下，CE-LIF獲得了8個峰，且小于15 000 bp的片段分離度大于1.46，且其重復性也更好，遷移時間相對標準偏差均＜0.35%，校正峰面積百分比均＜5.65%［36］。

2.2.2 基于高效液相色譜技術（high performance liquid chromatography，HPLC）的純度和雜質分析 作為現(xiàn)代藥品檢測的常用技術，在眾多類型HPLC中，反相色譜（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）、分子排阻色譜（size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography，SEC-HPLC）和離子交換色譜（ion exchange chromatography-high performance liquid chromatography，IEC-HPLC）已成為單抗類藥物不同方面質量檢定的常用技術手段。

RP-HPLC主要用于單抗類藥物的肽圖檢查，《中國藥典》四部（2015版）［15］通則3405表明，通過胰蛋白酶裂解單抗類藥物，形成肽段，采用RPHPLC分析鑒定其一級結構的完整性和準確性。肽圖是蛋白質及其酶解產物的指紋圖譜，是單抗類藥物質量控制和放行的必行檢測。該項檢測可監(jiān)控單個氨基酸的突變、氧化、去酰胺化，也能檢測單抗類藥物N-末端環(huán)化、C-末端賴氨酸處理、N-糖基化等一系列非預期的表達變異［25］。肽圖分析包含4個主要步驟：蛋白的分離純化、選擇性酶切、多肽的色譜分離、多肽的分析和鑒定。肽圖分析應得到足夠的肽段和盡可能高的覆蓋度以進行有效的分析［37］，但該方法并未將二硫鍵還原處理成還原狀態(tài)自由巰基的預處理步驟收錄其中，如缺失上述步驟，采用胰蛋白酶裂解單抗類藥物幾乎得不到裂解峰［38］。對于采用紫外檢測器的RP-HPLC肽圖分析，最重要的是具有足夠大的分離度，以分離所有的組分峰，使用小粒徑的長柱及超高效液相色譜系統(tǒng)（ultra performance liquid chromatography，UPLC）可大幅提高分離效率和速度。

《中國藥典》四部（2015版）［15］通則0514表明，SEC-HPLC可通過分子篩原理將蛋白質按多聚體、二聚體、單體及某些情況下出現(xiàn)的片段等小分子順序分離，依次通過檢測器。因此SEC-HPLC廣泛應用于單抗類藥物聚合物的檢測，是目前常用的質控及放行檢測方法。SEC-HPLC可定量，二聚體和聚集體的分離度較高，分析時間較短，且操作簡單，可收集流分進行進一步分析［39］。在SEC-HPLC分離中，樣品將在1個柱體積內通過等度分離洗脫，因此，進樣器、管路和檢測器體積在內的液相系統(tǒng)總體積會影響分離效果。通常，與柱體積相關的液相系統(tǒng)總擴散體積越小，峰型越窄，分離效果越好。GOYON等［40］發(fā)現(xiàn)，使用小粒徑（3μm）色譜柱比使用傳統(tǒng)5μm粒徑色譜柱可獲得更高的流速，且不影響分離度與柱效。隨后，RICHARD等［41］報道也表明，除使用更合理的流動性pH之外，更小粒徑的SEC-HPLC色譜柱能提供更好的分離度與更快的分離速度。

IEC-HPLC是考察單抗類藥物電荷異質性的另一種手段，與CE比較，操作更簡單，且能檢測蛋白分子表面電荷分布差異的優(yōu)勢［26］。弱陽離子交換色譜柱常用于測定單抗類藥物存在的酸性電荷異構體（先于主峰出峰）與堿性電荷異構體（晚于主峰出峰）。這些電荷異構體多為主峰蛋白糖基化和去酰胺化的產物，但其有限的分辨率無法將各雜質精確分離，該缺點也限制了其在單抗類藥物質量控制領域更深入地應用［42］。

隨著質譜技術的發(fā)展，液相色譜與質譜聯(lián)用技術在單抗類藥物質量控制領域發(fā)揮著越來越重要的作用。四極桿-飛行時間（quadrupole time-offlight，QTof）高分辨質譜、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption／ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-Tof-MS）及結合了高選擇性四極桿離子過濾與Orbitrap高分辨準確質量數(shù)技術的QE高分辨質譜，在完整蛋白、肽圖分析、寡糖分析、蛋白定量、蛋白測序等單抗類藥物質量控制領域具有明顯優(yōu)勢，見表1［43-48］。

表1 質譜技術在單抗類藥物質控領域中的應用Fig.1 Application of mass spectrometry for quality control of monoclonal antibody drugs

另外，親水作用液相色譜（hydrophilic interaction liquid chromatography-high performance liquid chromatography，HILIC-HPLC）配以熒光檢測器（fluorescence detector，F(xiàn)LD）或電噴霧檢測器（corona chaged aerosol detection，CAD）也在單抗類藥物相關質量控制方面發(fā)揮著重要作用，如寡糖鏈分析與工藝中引入的表面活性劑與藥用輔料檢測等［49-50］。隨著多維液相色譜技術的發(fā)展，二維液相色譜（two dimensionalhigh performance liquid chromatography，2D-HPLC）可將樣品中難分離、需富集的雜質分離或富集用于與質譜、紅外和核磁共振等的聯(lián)用分析中，在單抗類藥物雜質分離與鑒定等分析中發(fā)揮著越來越重要的作用［51］，如VANHOENACKER等［52］采用2D-HPLC與QTof高分辨質譜聯(lián)用分析經處理和未經處理的曲妥單抗酶解物，結果表明，采用HILIC的第一維液相與采用RPLC的第二維液相在兩個維度間提供了良好的正交性，2D-HPLC與高分辨質譜的結合在肽圖詳細分析方面具有較大潛力。

2.2.3 細胞殘留雜質分析 單抗類藥物除了進行常規(guī)的無菌試驗、異常毒性、熱源試驗、內毒素等安全性檢查外，其生產過程中HCP、DNA及純化過程使用的親和色譜蛋白A（Protein A）等工藝雜質殘留量也需進行嚴格控制［53］。這些由生產過程引入的殘留雜質不僅影響產品的效價，還可能在不同程度上引起機體的免疫應答，最終引起過敏反應或毒性、免疫原性、致癌性等嚴重的安全性問題［54］。

美國FDA規(guī)定，用一種靈敏度較高的方法檢測藥品的HCP，其含量應低于檢測限（通常＜100 ppm）［18］；《中國藥典》三部（2015版）［14］規(guī)定，CHO細胞HCP占總蛋白含量的0.05%以下［14］。雖然目前國際上針對HCP的殘留限度尚無統(tǒng)一標準，但ELISA法是與國際接軌的常用單抗類藥物HCP及Protein A殘留的檢測方法，也是目前《生物制品質量控制分析方法驗證技術審評一般原則》中推薦的檢測方法［55］，但ELISA法在《中國藥典》四部（2015版）［15］通則并未收載［15］。另外，質譜檢測在HCP定量也有所應用，BOMANS［56］使用Orbitrap高分辨質譜監(jiān)控純化過程中的HCP含量變化，并在最終藥物中鑒定到多種低豐度的HCP，對純化方法的優(yōu)化具有重要的參考意義。

WHO及國內外藥物監(jiān)管機構要求，CHO宿主細胞DNA殘留量應不高于10 pg。《美國藥典》（USP41-NF36版）［57］指出，定量PCR法（q-PCR）的適用性較其他檢測方法更好。q-PCR法對樣品的前期處理要求較高，但我國尚未建立統(tǒng)一的國家藥品質量控制標準核酸信息平臺和DNA殘留量標準檢測方法，單抗類藥物中CHO宿主細胞殘留DNA的檢測均由各生產廠家自行檢測。宿主細胞DNA殘留國內外常用的q-PCR法在《中國藥典》四部（2015版）［15］通則中也未收載。

3 展望

隨著單抗類藥物研究的深入及分析技術的發(fā)展，質量源于設計（quality by design，QbD）質量控制理念的推廣，單抗類藥物雜質分析正向自動化、高特異性、高準確度、高靈敏度、微型化及高通量實時快速檢測的方向發(fā)展［41］，如芯片實驗室（Lab-On-Chip）技術在雜質殘留檢測領域不斷發(fā)展與探索［58］；自動化處理平臺高通量蛋白純化、酶解、脫鹽、多肽分級、糖鏈富集等自動化流程日趨成熟［59］；高分辨質譜（high resolution mass spectrometry，HRMS）定性定量技術在過程開發(fā)及批放行中的逐漸普及［40］。這些分析技術的發(fā)展正推動著越來越多的新技術、新方法在單抗類藥物雜質分析領域得到應用。同時，隨著單抗類藥物的臨床應用，出現(xiàn)了越來越多的不良反應，對引起這些不良反應的相關雜質的深入研究將對單抗類藥物的有效性、安全性和一致性的提升起到推動作用。