楊海鵬， 曹 丹， 劉小紅， 陳 偉， 張紅梅， 劉婭娟

(1.山西省農業(yè)科學院玉米研究所， 山西 忻州 034000；2.西華師范大學生命科學學院， 四川 南充637000)

玉米(ZeamaysL.)是世界上最主要的三大禾谷類作物之一，起源于中美洲和南美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)的高地，適宜于較溫暖的環(huán)境。雖然光照、溫度、水分、CO2等生態(tài)條件對玉米生長都有影響，但溫度始終是影響玉米生長發(fā)育的重要因素之一[1]。近年來，隨著全球氣溫的升高及極端高溫天氣的頻發(fā)，高溫已成為限制作物生產的重要非生物脅迫因子之一。高溫脅迫會影響玉米開花、授粉和籽粒灌漿，導致結實率下降，從而降低玉米產量。因此，高溫對玉米生產的不利影響越來越受到關注。

玉米開花散粉期，在中國黃淮海地區(qū)、西南部分地區(qū)特別容易遭遇高溫天氣，導致玉米花粉活力下降，嚴重影響玉米的受精結實，玉米產量大幅下降[2]。但是，不同玉米品種對高溫天氣的耐受性存在差異[3]，當前絕大多數(shù)品種都不耐高溫，但經(jīng)過育種家們的努力，現(xiàn)也選育出少量耐高溫的玉米品種，如中地88，在散粉期遭遇42 ℃的高溫，其花粉活力幾乎不受影響。因此，研究玉米花粉耐高溫脅迫的分子遺傳機制具有重要意義。

半乳糖是動植物體內一種重要的單糖，主要由乳糖分解而來，可以經(jīng)一系列代謝步聚轉換成葡萄糖、果糖或其他小分子物質，從而被細胞吸收利用[4]。體內的半乳糖代謝具有非常復雜的通路，涉及許多的酶和其他小分子輔助物參與。其中，ATP依賴的6-磷酸果糖激酶(ATP-dependent 6-phosphofructokinase,ATP-PFK)、半乳糖異構酶(galactose mutarotase,GalM)和己糖激酶(hexokinase,HXK)等都是在半乳糖代謝通路中的重要酶蛋白。這些酶除參與半乳糖代謝外，還具有很多其他的生物學功能[5-6]，如HXK在糖酵解途徑中，是糖氧化反應過程的限速酶或稱關鍵酶[7]。因此，克隆分析這些酶蛋白基因具有重要的生物學意義。

基因差異表達分析是克隆耐逆境脅迫基因的重要手段，轉錄組測序又是實現(xiàn)這一目的的強大工具[8-10]。目前，轉錄組測序技術已廣泛應用于作物物種發(fā)現(xiàn)差異表達基因，包括水稻[11-12]、玉米[13-14]、小麥[15-16]、大豆[17]、大麥[18]、高梁[19]、棉花[20]等?；诖?，本研究借助轉錄組高通量測序技術，以高溫環(huán)境下具有不同耐高溫脅迫能力的玉米品種的花粉為材料，對ATP依賴的6-磷酸果糖激酶基因、半乳糖異構酶基因和己糖激酶基因進行了克隆測序分析，并進一步對這幾個基因在花粉細胞中的差異表達及酶參與的半乳糖代謝通路進行詳細分析，以了解這些基因和表達酶蛋白的結構和功能，為玉米其他代謝通路的類似研究提供分子參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為中地88(耐高溫脅迫)和先玉335(不耐高溫脅迫)兩個玉米品種。

1.2 方 法

1.2.1玉米半乳糖代謝相關基因的克隆

在42 ℃高溫的田間大棚里取2個材料的花粉，每個材料設置3個生物學重復，進行轉錄組測序分析，從轉錄組測序結果文件中搜索得到與玉米半乳糖代謝相關的差異表達基因的序列信息。

1.2.2基因及蛋白的生物信息學分析

基因的編碼信息及表達蛋白的生物學特性由網(wǎng)絡在線工具分析完成，具體包括：

1)開放閱讀框https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/；序列同源比對：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/；

2)蛋白理化性質：https://web.expasy.org/protparam/；

3)蛋白功能位點：https://prosite.expasy.org/；

4)蛋白結構：①保守結構域：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/；②二級結構：http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/；③三級結構：https://www.swissmodel.expasy.org/。

1.2.3基因的差異表達分析

基于轉錄組測序，對半乳糖代謝相關基因的表達進行統(tǒng)計，包括五個參數(shù)：

1)平均表達量：進行差異比較的兩組全部樣品該基因read count的均一化結果；

2)對照表達量：對照組全部樣品該基因read count的均一化結果；

3)處理表達量：處理組全部樣品該基因read count的均一化結果；

4)差異倍數(shù)：在基因的兩組表達量，較大值與較小值之比；

5)顯著性p值：差異顯著性統(tǒng)計值。

1.2.4半乳糖代謝通路分析

利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)工具分析本試驗中與半乳糖代謝相關的基因表達的酶蛋白在代謝通路中所處位置，分析酶催化的化學反應中的底物和產物。

2 結果與分析

2.1 基因克隆

通過對中地88和先玉米335的花粉細胞的轉錄組測序，獲得了4個與玉米半乳糖代謝相關的差異表達基因，包括2個ATP-PFK基因(zm-zx-pfk1和zm-zx-pfk2)，1個GalM基因(zm-zx-gm)和1個HXK基因(zm-zx-hxk)。這4個基因的cDNA全長分別為2 555 bp、2 775 bp、1 380 bp和2 256 bp，都為斷裂基因，含有大量內含子序列，分別位于第6、6、2號和3號染色體上。

2.2 基因編碼蛋白分析

2.2.1開放閱讀框和同源比對分析

對半乳糖代謝相關的4個基因編碼蛋白的開放閱讀框進行分析，結果如圖1～圖4所示。zm-zx-pfk1、zm-zx-pfk2、zm-zx-gm和zm-zx-hxk基因全長為348個、288個、370個和407個，都含有20種不同氨基酸，帶負電荷氨基酸(Asp+Glu)含量分別為：49、31、34、54，帶正電荷的氨基酸(Arg+Lys)含量分別為：38、33、34、42。

利用NCBI網(wǎng)站的Protein Blast工具對這4個基因的編碼蛋白作同源性搜索，結果顯示，zm-zx-pfk1基因與玉米、高粱(Sorghumbicolor)和甘蔗(Saccharumofficinarum)的ATP-PFK基因的一致性分別為100%(XP_008649908.1)、95.45%(OQU 78332.1)和96.56%(AWA 44824.1)；zm-zx-pfk2基因與玉米、高粱和甘蔗的ATP-PFK基因的一致性分別為100%(AQK 87784.1 AQK 80438.1)、91.79%(XP_002437847.1)和93.28%(AGT16840.1)；zm-zx-gm基因與玉米GalM基因的一致性為100%(ONM 16962.1 AQK 80438.1)，與玉米、高粱和小米(Setariaitalica)的醛糖-1-異構酶基因的一致性分別為98.66%(PWZ 38696.1)、87.50%(XP_002446609.1)和82.09%(XP_004975841.1)；zm-zx-hxk基因與玉米、小米和高粱的HXK基因的一致性分別為95.90%(ONM 38338.1AQK 80438.1)、92.09%(XP_004969912.1)和79.31%(XP_002458467.1)。

2.2.2理化性質分析

對玉米半乳糖代謝相關的4個基因的理化性質利用在線工具ProtParam進行預測，結果如表1所示。這4個基因的分子量都較大，其分子量大小與所含氨基酸數(shù)量呈正相關；從等電點可以看出，zm-zx-pfk1和zm-zx-hxk顯酸性，而zm-zx-pfk2和zm-zx-gm顯堿性；從不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族指數(shù)和平均親水系數(shù)可以看出，這4個基因的編碼蛋白均屬穩(wěn)定親水性蛋白。

表1 玉米半乳糖代謝相關基因編碼蛋白的理化性質

此外，還對這4個基因的編碼蛋白利用網(wǎng)絡在線工具NetPhos 3.1作了磷酸化修飾分析，結果表明，m-zx-pfk1基因編碼蛋白含有17個絲氨酸位點、11個蘇氨酸位點和8個酪氨酸位點；zm-zx-pfk2基因編碼蛋白含有9個絲氨酸位點、10個蘇氨酸位點和5個酪氨酸位點；zm-zx-gm基因含有13個絲氨酸位點、14個蘇氨酸位點和4個酪氨酸位點；zm-zx-hxk基因編碼蛋白含有15個絲氨酸位點、10個蘇氨酸位點和6個酪氨酸位點。

2.2.3功能位點分析

利用網(wǎng)絡在線工具Prosite對半乳糖代謝相關的4個基因的編碼蛋白的功能位點進行預測，含有的功能位點種類、數(shù)量及在氨基酸序列中的位點見表2。在這5種功能位點中，zm-zx-pfk2基因編碼蛋白最少，只含有3種(2個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、6個蛋白激酶C磷酸化位點和8個cAMP和cGMP依賴型蛋白激酶磷酸化位點)；zm-zx-pfk1基因編碼蛋白有4種(10個N-豆蔻?；稽c、2個N-糖基化位點、4個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和6個蛋白激酶C磷酸化位點)；zm-zx-gm基因編碼蛋白也含有同樣的4種(9個N-豆蔻?；稽c、2個N-糖基化位點、5個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和6個蛋白激酶C磷酸化位點)；zm-zx-hxk基因編碼蛋白含有的功能位點種類最多，包含了全部5種(11個N-豆蔻?；稽c、2個N-糖基化位點、7個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、1個蛋白激酶C磷酸化位點和1個cAMP和cGMP依賴型蛋白激酶磷酸化位點)。

表2 玉米半乳糖代謝相關基因編碼蛋白的功能位點

2.2.4結構分析

利用保守結構域在線工具Conserved Domains對zm-zx-pfk1、zm-zx-pfk2、zm-zx-gm和zm-zx-hxk基因編碼蛋白進行分析，結果表明，分別含有磷酸果糖激酶結構域(85-348)、磷酸果糖激酶結構域(62-261)、醛糖-1-異構酶結構域(27-369)和己糖激酶結構域(2-405)。半乳糖異構酶屬于醛糖-1-異構酶。

對4個基因表達蛋白的二級結構利用網(wǎng)絡在線工具Psipred進行分析，結果顯示，zm-zx-pfk1基因編碼蛋白有12個螺旋區(qū)，12個折疊區(qū)；zm-zx-pfk2基因有6個螺旋區(qū)，11個折疊區(qū)；zm-zx-gm基因編碼蛋白有5個螺旋區(qū)，23個折疊區(qū)；zm-zx-hxk基因編碼蛋白有13個螺旋區(qū)，12個折疊區(qū)。除螺旋區(qū)和折疊區(qū)外，這4個基因都含有大量無規(guī)則卷曲區(qū)。

對4個基因表達蛋白的三級結構利用網(wǎng)絡在線工具SWISS-MODEL分析完成，zm-zx-pfk1、zm-zx-pfk2、zm-zx-gm和zm-zx-hxk基因編碼蛋白的模型1的參照模板分別為6 qu 5.1.A、6 qu 3.1.A、1 snz.1.A和6 jj7.1.A，其對蛋白名稱的描述與保守結構域在線分析結果完全一致。

2.3 基因表達分析

本試驗中克隆的4個半乳糖代謝相關基因在中地88(處理)和先玉335(對照)兩個玉米材料中的表達情況作統(tǒng)計分析，結果如表3所示。從表3可以看出，這4個基因的表達均呈極顯著差異，其中zm-zx-pfk1基因上調表達，其差異倍數(shù)高達26.19；zm-zx-pfk2、zm-zx-gm和zm-zx-hxk三個基因表現(xiàn)相反，為下調表達，其差異倍數(shù)分別達到2.86、3.94倍和2.64倍。

表3 玉米半乳糖代謝相關基因的表達統(tǒng)計

2.4 代謝通路分析

本試驗中的這4個基因編碼蛋白都參與了半乳糖代謝，在半乳糖代謝通路中所處位置如圖5所示。在通路2.7.1.11(紫色)位置包括了zm-zx-pfk1和zm-zx-pfk2兩個基因的編碼蛋白，這兩個基因表達模式相反，其中zm-zx-pfk1為上調表達基因，而zm-zx-pfk2為下調表達基因，這兩個基因都表達ATP依賴的6-磷酸果糖激酶，雖然這兩個基因表達的蛋白不同，但都處在這個通路位置，具有相同的功能，都是促進D-塔格糖-1,6-二磷酸(D-Tagatose-1,6 P 2)與D-塔格糖-6磷酸(D-Tagatose-6 P)的相互轉化。在5.1.3.3(綠色)位置包括了zm-zx-gm基因的編碼蛋白，該基因為下調表達基因，表達的半乳糖異構酶催化D-半乳糖(D-Galactose)轉化為α-D-半乳糖(α-D-Galactose)。在2.7.1.11(綠色)位置包括了zm-zx-hxk基因的編碼蛋白，這個基因為下調表達基因，表達的己糖激酶催化α-D-葡萄糖(α-D-Glucose)和α-D-葡萄糖-6-磷酸(α-D-Glucose-6P)相互轉化。

3 討論與結論

3.1 討 論

在半乳糖代謝的KEGG通路中，D-半乳糖通過Leloir途徑產生更有利于代謝利用的D-葡萄糖-1-磷酸，在這個過程中，需要多個酶參與，其中GalM是第一步需要的酶。關于半乳糖異構酶已有一些研究，如Scott A等[21]從釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中鑒定了一個GalM，并對其生物學活性作了一些鑒定。本試驗在玉米中鑒定的zm-zx-gm基因就可以表達GalM，該酶可以催化D-半乳糖轉變?yōu)棣?D-半乳糖，α-D-半乳糖再進一步在半乳糖激酶的作用下，轉變?yōu)棣?D-半乳糖-1-磷酸?；虮磉_結果顯示，zm-zx-gm基因在先玉335(ck)花粉中的表達量較高，而在中地88花粉中表達量較低，為下調表達，其差異倍數(shù)達到3.94倍。

ATP-PFK可以在有ATP提供磷酸基的情況下，催化果糖-6-磷酸轉化為果糖-1,6-二磷酸，該酶目前已在細菌和一些真核生物中被鑒定[22-24]，如Hansen等[25]鑒定了一個來自嗜熱細菌海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)的ATP-PFK，大小為140 kDa，是一個同源四聚體蛋白，單個亞基為34 kDa，ATP-PFK是經(jīng)典Embden-Meyerhof途徑糖酵解的關鍵酶之一[26]。在本試驗中，zm-zx-pfk1和zm-zx-pfk2兩個基因的ATP-PFK表達物在KEGG通路中，參與了半乳糖代謝，其功能是催化D-塔格糖-6磷酸轉化為D-塔格糖-1,6-二磷酸(塔格糖是果糖的一種異構物)，但這兩個基因的表達物是不同的依賴于ATP的6-磷酸果糖激酶，zm-zx-pfk1基因表達蛋白分子量較大，pH值小于7，呈酸性，而zm-zx-pfk2基因的表達蛋白分子量較小，但pH值要大得多，呈堿性。在玉米花粉細胞中，zm-zx-pfk1基因上調表達，差異倍數(shù)超過26倍，zm-zx-pfk2則相反，為下調表達，但差異倍數(shù)僅有2.86倍。

HXK在植物中是唯一能磷酸化修飾葡萄糖的一種激酶，同時還能磷酸化修飾果糖[27-28]，除了其催化磷酸化活性外，HXK還有其他一些生物學活性[29]，如可以作為糖傳感器發(fā)揮作用，而不依賴于其磷酸化活性[5]；可以感知葡萄糖和果糖的水平，并產生激活關閉氣孔的脫落酸(ABA)途徑的信號[30]。本研究中，zm-zx-hxk基因表達的HXK在半乳糖代謝的KEGG通路中，具有一樣的活性，可以催化α-D-葡萄糖轉化為α-D-葡萄糖-6-磷酸，使得α-D-葡萄糖進入糖酵解途徑，從而被代謝利用。但是這個基因在不同玉米材料中呈現(xiàn)差異表達，本試驗中，在先玉335中表達量明顯高于中地88，其差異倍數(shù)達到了2.64倍。

上述4種酶都是KEGG半乳糖代謝通路中非常重要的酶，本試驗在高溫脅迫條件下，對玉米花粉細胞中的這4個酶基因的結構和差異表達作了相關分析，為進一步的基因克隆及功能分析提供了分子基礎。這4個基因的表達與玉米耐受高溫脅迫的關系，以及玉米細胞中相關酶蛋白的純化及功能鑒定尚需進一步研究。

3.2 結 論

本研究以耐高溫脅迫差異明顯的兩個玉米品種材料，在高溫環(huán)境對其花粉細胞的轉錄組進行測序分析，克隆得到4個與半乳糖代謝相關的基因(zm-zx-gm、zm-zx-pfk1、zm-zx-pfk2和zm-zx-hxk)，并對這幾個基因作了進一步的結構和表達分析，結果如下：

1)生物信息學分析結果表明：這4基因全長分別為2 555 bp、2 775 bp、1 380 bp和2 256 bp，都為斷裂基因，含有大量內含子序列，分別位于第6、6、2號和3號染色體上。其開放閱讀框分別可以編碼348、288、370個和407個氨基酸。并進一步對其編碼的蛋白的理化性質、功能位點及結構作了分析，所有這些結果都顯示，zm-zx-gm基因編碼半乳糖異構酶；zm-zx-pfk1基因和zm-zx-pfk2基因編碼不同的磷酸果糖激酶；zm-zx-hxk基因編碼己糖激酶。

2)基因表達分析結果顯示，這4個基因在兩個玉米花粉細胞中呈現(xiàn)明顯的差異表達，以高溫敏感材料先玉335為對照，在處理材料中地88中，zm-zx-pfk1基因上調表達，差異倍數(shù)高達26.19倍，zm-zx-pfk2、zm-zx-gm和zm-zx-hxk3個基因則相反，為下調表達，差異倍數(shù)分別為2.86，3.94倍和2.64倍。

3)KEGG通路分析結果表明，這4個基因的表達產物都參與了半乳糖代謝，zm-zx-gm基因產物催化D-半乳糖(D-Galactose)轉化為α-D-半乳糖(α-D-Galactose)；zm-zx-pfk1和zm-zx-pfk2基因產物都是促進D-塔格糖-6磷酸轉化為D-塔格糖-1,6-二磷酸，但反應是可逆的；zm-zx-hxk基因產物表達催化α-D-葡萄糖(α-D-Glucose)轉化為α-D-葡萄糖-6-磷酸(α-D-Glucose-6P)，該反應也可逆。

本試驗結果豐富了玉米細胞中半乳糖代謝途徑中的基因和酶蛋白信息，為進一步酶的純化及功能分析奠定了分子基礎，也為其他植物的類似研究提供了參考。