胡冰濤 王曉春

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作為成體干細(xì)胞的一種，可以從骨髓、脂肪、外周血和牙髓等成體組織中分離，具備多向分化能力、高度增殖能力、免疫調(diào)節(jié)能力和致畸風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療中[1]。但同時(shí)干細(xì)胞療法也存在一些問題，如機(jī)體免疫排斥、干細(xì)胞遺傳物質(zhì)變異和體外擴(kuò)增不易保存等問題[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可釋放出大量細(xì)胞外納米顆粒參與組織損傷修復(fù)過程，外泌體作為其中之一備受關(guān)注。外泌體是由真核細(xì)胞向胞外分泌的微囊泡，含有多種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和遺傳物質(zhì)，參與細(xì)胞間信號傳遞和遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生理、病理過程。在臨床診療過程中，口腔頜面部血管、神經(jīng)、牙齒和關(guān)節(jié)軟骨等組織的損傷，嚴(yán)重危害患者的身心健康。然而利用MSCs外泌體既可保留干細(xì)胞原有功能，又可以避免細(xì)胞移植相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)和限制[3]。因此，MSCs外泌體有可能作為無細(xì)胞療法在口腔頜面部組織再生研究領(lǐng)域中的潛在解決方案。

一、外泌體概述

1.外泌體的生物學(xué)特征：外泌體最初是在成熟哺乳動(dòng)物的網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，是直徑約30～150nm的細(xì)胞外囊泡，密度為1.11～1.19g/ml，在透射電鏡下觀察多數(shù)為圓形或杯形。外泌體可由不同類型的細(xì)胞分泌釋放，如神經(jīng)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞等，并廣泛存在于各種體液中[4]。人們普遍認(rèn)為，外泌體的形成始于細(xì)胞內(nèi)陷的后期，在與細(xì)胞膜接觸后以“內(nèi)吞-融合-外排”的形式排出，形成具有磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡體[5]。外泌體中所含有的蛋白質(zhì)主要包括參與其結(jié)構(gòu)形成的膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合相關(guān)蛋白Rab、膜聯(lián)蛋白及各類運(yùn)輸?shù)鞍?，還有四跨膜蛋白超家族(CD9、CD63、CD81和CD82等)、熱休克蛋白家族和各種特異性蛋白質(zhì)分子。外泌體依靠其豐富的脂質(zhì)如膽固醇、鞘磷脂和磷酸甘油酯等維持形態(tài)，同時(shí)也可以傳遞信號分子介導(dǎo)的生物信息[6]。外泌體內(nèi)部含有特定的遺傳信息和細(xì)胞因子可以使其作為介入靶點(diǎn)，在促進(jìn)組織修復(fù)再生、免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞凋亡及調(diào)控腫瘤生長等方面發(fā)揮重要作用[7,8]。

外泌體對受體細(xì)胞的生物學(xué)作用可能有兩種機(jī)制：①外泌體膜蛋白直接或間接與靶細(xì)胞相互作用并激活細(xì)胞內(nèi)信號傳遞的內(nèi)吞作用；②外泌體與靶細(xì)胞膜融合或被靶細(xì)胞內(nèi)吞，以非選擇性的方式釋放其“貨物”(miRNA、蛋白質(zhì)和mRNA)進(jìn)入靶細(xì)胞，從而調(diào)控基因表達(dá)和一系列后續(xù)的生物學(xué)效應(yīng)[9]。

2.外泌體的提取、保存及鑒定：外泌體是納米級大小的細(xì)胞外囊泡，因其體積較小導(dǎo)致提取難度較大。目前用于外泌體的提取技術(shù)主要有：超速離心法、超濾法、免疫親和法、聚合物沉淀法、分子排阻色譜法和集成微流控法等[10]。盡管這些方法已廣泛應(yīng)用，但仍有其缺點(diǎn)，比如提取純度低、獲取量少、耗費(fèi)時(shí)間長、可能對外泌體造成機(jī)械損傷等，并且不同的提取方法得到的外泌體的理化性質(zhì)各不相同，這會對后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究帶來極大的不可控性。所以，外泌體的提取問題仍然是未來外泌體應(yīng)用發(fā)展的關(guān)鍵。

合理的保存方法對維系外泌體的直徑和完整性有著重要的作用。研究表明，將已成功提取的外泌體放在常溫下保存2天后，直徑降低60%。在4℃環(huán)境下保存3～4天后，直徑降低25%。在-20℃環(huán)境下，其直徑在1周以內(nèi)無明顯變化。而在-80℃環(huán)境下的外泌體可以維持穩(wěn)定狀態(tài)，適宜長期儲存[11]。

外泌體的鑒定通常會采用觀察形態(tài)學(xué)特征、分析粒徑分布大小和檢測特異性蛋白標(biāo)志物等方法。目前用于鑒定的儀器主要有透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、冷凍電子顯微鏡、原子力顯微鏡、納米顆粒跟蹤分析儀、流式細(xì)胞儀、免疫印跡分析儀和酶聯(lián)免疫檢測儀等。而一般實(shí)驗(yàn)研究會使用以上2～3種方法或儀器進(jìn)行聯(lián)合鑒定。

二、外泌體在口腔組織再生中的研究

1.血管組織再生：血運(yùn)重建是口腔頜面部組織損傷后修復(fù)與再生中不可缺少的過程，豐富的血運(yùn)形成對新生組織的生長具有促進(jìn)作用，是機(jī)體生長發(fā)育的重要基礎(chǔ)。牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是MSCs的一個(gè)亞群，它不僅與MSCs有極其相似的免疫表型和增殖分化能力，而且來源豐富，取材簡便，無倫理爭議[12]。Xian等[13]探究DPSCs外泌體在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的促血管生成特性，隨后發(fā)現(xiàn)外泌體可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和促血管生成因子的表達(dá)，并且通過使用P38 MAPK抑制劑提升了血管形成能力。還有研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)低氧誘導(dǎo)因子的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)來源的外泌體可通過增強(qiáng)Notch信號通路中Jagged1的表達(dá)促進(jìn)血管生成能力，這可能在口腔組織再生治療方面有潛在的應(yīng)用[14]。Qiu等[15]在小鼠皮膚損傷模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由新生小鼠血清培養(yǎng)的MSCs外泌體通過AKT/eNOS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能，促進(jìn)了傷口愈合和血管生成，為皮膚損傷修復(fù)提供了一種新的無細(xì)胞治療策略。

綜上所述，MSCs來源的外泌體主要通過增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性和增殖能力，在血管生成中起到重要作用，這為外泌體應(yīng)用于口腔頜面部組織損傷后修復(fù)與再生提供新思路。但是不同來源的MSCs外泌體在促血管形成能力上有很大差異，未來需要投入更多精力去尋找最適宜血管組織再生的外泌體來源。

盡管目前大部分的研究局限于體外觀察，并且MSCs外泌體對神經(jīng)再生的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索，但其神經(jīng)組織保護(hù)與促進(jìn)神經(jīng)再生作用已為口腔頜面部組織的再生提供新策略。

3.牙髓組織再生：牙髓組織容易因齲病、外傷、牙周炎逆行性感染等因素發(fā)生炎癥，炎癥的持續(xù)發(fā)展會導(dǎo)致牙髓及根尖部周圍組織壞死[20]。根管治療是牙髓疾病中常用的治療方法，在這個(gè)過程中，完全去除發(fā)炎或壞死的牙髓，并用合成材料嚴(yán)密封閉整個(gè)根管系統(tǒng)。雖然根管治療已被證明是有效的，但由于失去天然牙髓組織的營養(yǎng)和保護(hù)作用，剩余的牙齒結(jié)構(gòu)抗力下降，脆性增加，有牙折的風(fēng)險(xiǎn)。因此，牙髓組織再生的作用顯得尤為重要。

Huang等[21]探索了DPSCs外泌體誘導(dǎo)牙源性分化的潛力，發(fā)現(xiàn)外泌體可以與基質(zhì)蛋白(例如Ⅰ型膠原蛋白和纖維蛋白)相結(jié)合，從而使它們能夠附著于生物材料，通過內(nèi)吞機(jī)制被DPSCs內(nèi)吞并觸發(fā)P38 MAPK信號途徑，促進(jìn)牙源性分化和組織再生。此外在其牙根切片模型上也證明了外泌體可以誘導(dǎo)牙髓樣組織的再生。Hu等[22]分別從正常條件下和牙源性分化條件下培養(yǎng)的DPSCs中提取外泌體并進(jìn)行miRNA測序，結(jié)果表明，牙源性分化條件下培養(yǎng)DPSCs所得到的外泌體被內(nèi)吞后，通過上調(diào)DSP、DMP-1、ALP和RUNX2蛋白誘導(dǎo)DPSCs牙源性分化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中的miRNA通過下調(diào)隱性TGF-β結(jié)合蛋白1促進(jìn)了由TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的牙源性分化。Zhuang等[23]將來自根尖乳頭的干細(xì)胞(stem cells from apical papilla，SCAP)分泌的外泌體引入含有BMSCs的牙根片段中，并將其皮下移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，結(jié)果觀察到有牙髓牙本質(zhì)復(fù)合物樣組織生成，結(jié)合體外研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SCAP外泌體處理的BMSCs中牙本質(zhì)涎磷蛋白基因的表達(dá)以及礦化結(jié)節(jié)的形成均顯著增加，這說明使用牙源性MSCs外泌體試劑可能是實(shí)現(xiàn)牙髓組織損傷后修復(fù)與再生的新選擇。

4.牙周組織再生：牙周炎是導(dǎo)致牙周支持組織發(fā)生慢性進(jìn)行性破壞的一種炎癥性疾病，可引起牙槽骨的吸收和牙周附著喪失，是導(dǎo)致成年人牙齒松動(dòng)、脫落的主要原因。因此，實(shí)現(xiàn)牙槽骨再生和恢復(fù)牙周附著水平是獲得牙周組織再生的關(guān)鍵步驟。

Wei等[24]將SHED來源的外泌體注射到小鼠牙周炎模型的骨缺損區(qū)域中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外泌體修復(fù)骨缺損的程度和原始干細(xì)胞相同，并且還可以特異性促進(jìn)BMSCs的成骨作用與抑制脂肪的形成。Chew等[25]將負(fù)載有人MSCs源性外泌體的膠原蛋白海綿作用于牙槽骨缺損的大鼠模型，結(jié)果觀察到牙槽骨和功能性牙周膜纖維的再生。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，MSCs外泌體通過激活A(yù)KT和ERK信號通路，促進(jìn)了牙周膜細(xì)胞的增殖和遷移，從而實(shí)現(xiàn)缺損骨組織的再生。綜上所述，外泌體可以通過促進(jìn)骨缺損區(qū)域周圍細(xì)胞的增殖和成骨分化，實(shí)現(xiàn)牙周組織的再生。

5.關(guān)節(jié)軟骨組織再生：顳下頜關(guān)節(jié)(temporomandibular joint，TMJ)是由下頜骨髁突和顳骨之間形成的纖維軟骨覆蓋的復(fù)雜關(guān)節(jié)。在TMJ疾病治療中，越來越多的研究者將干細(xì)胞、支架和外泌體結(jié)合在一起進(jìn)行研究。Luo等[26]研究發(fā)現(xiàn)，來自SHEDs攜帶miR-100-5p的外泌體通過激活mTOR信號通路抑制TMJ中軟骨細(xì)胞的炎性反應(yīng)。Zhang等[27]將MSCs外泌體注射到單碘乙酸誘導(dǎo)的TMJ骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型的關(guān)節(jié)腔室中，通過調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，外泌體明顯加快了髁突軟骨和軟骨下骨的愈合，促進(jìn)了關(guān)節(jié)軟骨組織的修復(fù)和再生，這不僅證明了MSCs外泌體在TMJ疾病治療中的潛力，而且在關(guān)節(jié)軟骨再生領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

三、外泌體在組織工程的應(yīng)用

近年來，以細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程取得了良好的臨床效果，然而干細(xì)胞移植的非定向分化、免疫排斥和醫(yī)學(xué)倫理學(xué)爭議等問題限制了其應(yīng)用潛能。因此，研究者也在積極地探索其他的無細(xì)胞治療方法。作為MSCs旁分泌作用的重要組成部分，基于外泌體的治療在口腔組織工程中顯示出令人興奮的應(yīng)用前景。Swanson等[28]使用一種以降解性能可調(diào)的自組裝合成為基礎(chǔ)的三嵌段共聚物載體來封裝和控制釋放牙源性干細(xì)胞外泌體，并通過大鼠牙髓切除模型評估其作為生物材料在牙髓再生治療中的潛力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，釋放出來的外泌體促進(jìn)了牙源性基因的表達(dá)和修復(fù)性牙本質(zhì)的形成，并誘導(dǎo)牙髓組織再生。Ivica等[29]將DPSCs外泌體與纖維蛋白凝膠藥物傳遞系統(tǒng)結(jié)合，共同作用于MSCs，發(fā)現(xiàn)外泌體能夠顯著誘導(dǎo)MSCs自發(fā)性聚集并促進(jìn)其增殖能力，這表明注射纖維蛋白凝膠中遞送的外泌體可能是無細(xì)胞再生牙髓治療的有力工具，有望成為填充牙體硬組織的新方法。

四、展 望

在過去的幾十年中，MSCs來源的外泌體作為再生醫(yī)學(xué)研究的焦點(diǎn)，得到越來越多的關(guān)注。大量實(shí)驗(yàn)也圍繞它而展開，已經(jīng)在各種口腔疾病的模型中取得了令人欣慰的治療效果。越來越多的證據(jù)表明，干細(xì)胞外泌體具有諸多優(yōu)勢：①來源豐富，收集方法較多；②良好的生物相容性與穩(wěn)定性；③分子結(jié)構(gòu)較小，易通過血-腦脊液屏障，能作為天然分子載體靶向轉(zhuǎn)運(yùn)藥物；④可規(guī)避干細(xì)胞移植治療的風(fēng)險(xiǎn)等。但是目前對外泌體的研究大多局限于動(dòng)物模型，并沒有將其臨床應(yīng)用于人類口腔組織的修復(fù)與再生。此外，關(guān)于外泌體劑量和濃度的定義也存在爭議，這需要由專業(yè)的行業(yè)協(xié)會提出相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，明確不同細(xì)胞來源的外泌體誘導(dǎo)再生的作用機(jī)制依然是未來研究的重點(diǎn)。相信通過不斷地探索，外泌體將在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域擁有更多令人滿意的研究成果。