冀 旭 孫芳云 趙 勤 張曉英 李巖松

1.西藏民族大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712082；2.西藏民族大學(xué)藏藥檢測技術(shù)教育部工程研究中心，陜西 咸陽 712082

在生物學(xué)中，分子間相互作用與識別是形成高度專一性識別、反應(yīng)及調(diào)控等過程的基礎(chǔ)，諸如底物與受體的結(jié)合識別、酶反應(yīng)及抗體-抗原的結(jié)合識別等。而在藥學(xué)，尤其是民族藥的開發(fā)研究領(lǐng)域，分子間相互作用也是一個重要的研究內(nèi)容，它在基于傳統(tǒng)藥物的新藥篩選開發(fā)、藥物藥效學(xué)及藥動學(xué)研究中均得到廣泛應(yīng)用。藏藥在我國有著悠久的應(yīng)用歷史、深厚的民眾基礎(chǔ)及豐富的藏民族文化內(nèi)涵。近年來，藏藥以其獨(dú)特的功效受到越來越多研究者的關(guān)注，對其的現(xiàn)代化研究與應(yīng)用也日益得到重視。而關(guān)于藏藥當(dāng)中有效成分與離子通道、膜蛋白等藥物受體、功能蛋白的相互作用與識別研究還未見報道。

秦艽為龍膽科植物秦艽GentianamacrophyllaPall.，麻花秦艽GentianastramineaMaxim.，粗莖秦艽GentianacrassicaulisDuthie ex Burk.或小秦艽GentianadahuricaFisch.的干燥根[1]，屬于常用藏藥[2-4]，藏文名為吉解嘎保、吉解那保等[5]。該藥物為藏族人民的繁衍生息做出了重要的貢獻(xiàn)，如《四部醫(yī)典》中記載：“吉解嘎?？芍瘟瓱岷湍憻帷?；《如意寶樹》中記載：“吉解嘎?？芍寡?，炮制后外敷消腫、愈傷。吉解那保可消炎，治四肢關(guān)節(jié)紅腫，喉蛾，咽喉嘶啞”；《晶珠本草》中記載：“吉解那可用于消腫、喉蛾、干黃水”等[5]。櫟癭酸為一種五環(huán)三萜類化合物，是2015版《中國藥典》中規(guī)定秦艽藥材的藥材鑒別成分[1]，其藥理臨床作用如抗炎也常見報道[6]。

本研究以藏藥秦艽為代表，選用秦艽中有效成分櫟癭酸，利用光譜學(xué)方法研究了櫟癭酸與以運(yùn)載蛋白牛血清白蛋白(BSA)為代表的功能蛋白之間的相互作用與識別過程，旨在進(jìn)一步理解傳統(tǒng)藏藥有效成分的作用機(jī)制。并以此為例，建立一套可用于表征其它藏藥有效成分與功能蛋白如受體、離子通道等之間相互作用與識別的實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)而為傳統(tǒng)藏藥作用機(jī)制的現(xiàn)代化分析研究，以及基于傳統(tǒng)藏藥的藥物開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論支撐。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 PerkinElmer LS55熒光光譜儀及PTP-1 Peltier system控溫控件，Perkin Elmer Lambda 25紫外-可見分光光度儀器光度計，Millipore Milli-Q超純水系統(tǒng)。

1.2 主要試劑 櫟癭酸(中國食品藥品檢定研究院，98%)，用二甲基亞砜(DMSO，Sigma-Aldrich，≥99.9%)配置成濃度為4.0×10-2mol/L的儲備溶液。BSA(Amresco，>98%)用0.01mol/L的PBS配置成1×10-6mol/L的儲備溶液。華法林(中國食品藥品檢定研究院，98%)，布洛芬(大連美侖生物技術(shù)有限公司，>98%)，實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 熒光猝滅實(shí)驗(yàn) 移取1×10-6mol/L的BSA溶液 2 mL置于石英比色皿中并分別于288K、298K和308K實(shí)驗(yàn)溫度下測定樣品的熒光發(fā)射光譜。測定完成后，用微量注射器分別向其中注入不同體積的4.0×10-2mol/L的櫟癭酸儲備液進(jìn)行混合，使得櫟癭酸終濃度分別為5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6mol/L，混合完成后分別于相應(yīng)溫度下反應(yīng)至穩(wěn)定后再次測定其熒光發(fā)射光譜。相關(guān)儀器參數(shù)如下：激發(fā)波長278 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度均為3 nm，掃描速度1200 nm/min，掃描范圍300～400 nm。

2.2 結(jié)合位點(diǎn)競爭實(shí)驗(yàn) 移取1×10-6mol/L的BSA 溶液2 mL置于石英比色皿中，分別注入華法林/布洛芬儲備液，使對應(yīng)藥品終濃度均分別為1×10-6mol/L，在298 K溫度下進(jìn)行相互作用30 min。反應(yīng)完成后，用微量進(jìn)樣器分別向其中加入不同體積的櫟癭酸儲備液，使得櫟癭酸終濃度分別為5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6mol/L，混合完成至反應(yīng)穩(wěn)定后再次測定其熒光發(fā)射光譜。相關(guān)儀器參數(shù)如2.1。

2.3 同步熒光 于298K下移取1×10-6mol/L的BSA 溶液2 mL置于石英比色皿中，測定樣品同步熒光光譜。測定完成后，用微量注射器分別向其中加入不同體積的櫟癭酸儲備液進(jìn)行混合，使得櫟癭酸終濃度分別為5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6mol/L，反應(yīng)穩(wěn)定后于298 K溫度下分別測定其同步熒光光譜。相關(guān)儀器參數(shù)如下：當(dāng)測定Δλ=60 nm的同步熒光光譜時，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度均為3 nm。當(dāng)測定Δλ=15 nm的同步熒光光譜時，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度均為8 nm。掃描速度均為1200 nm/min，掃描范圍220～320 nm。

2.4 Rees紅邊激發(fā)熒光位移的測定 分別在激發(fā)波長為266、272、278、284、290和296 nm下，測定1×10-6mol/L的BSA溶液在298 K溫度下的熒光發(fā)射光譜，之后在BSA溶液中分別加入不同體積的櫟癭酸儲備液，使得櫟癭酸終濃度分別為0×10-6、5×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6mol/L，并測定其在不同激發(fā)波長下對應(yīng)熒光發(fā)射光譜。相關(guān)儀器參數(shù)如下：激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度均為3 nm，掃描速度1200 nm/min，掃描范圍300～400 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 BSA與櫟癭酸結(jié)合過程的熒光發(fā)射光譜分析 圖1所示為BSA與櫟癭酸在298 K溫度下作用過程的熒光發(fā)射光譜，可以看出，伴隨著櫟癭酸濃度的上升，樣品體系發(fā)生了熒光猝滅現(xiàn)象，熒光強(qiáng)度由754.3下降至487.9，同時最大熒光發(fā)射峰位從341 nm輕微的藍(lán)移至335.5 nm。這一現(xiàn)象表明BSA與櫟癭酸之間發(fā)生了相互作用，熒光發(fā)射峰位輕微藍(lán)移表明蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了細(xì)微的改變，蛋白結(jié)構(gòu)的疏水性有了輕微的增加[7]。

圖1 BSA與櫟癭酸作用的熒光發(fā)射光譜注：從上至下櫟癭酸濃度分別為0×10-6、5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6 mol/L

3.2 BSA與櫟癭酸相互作用的熒光猝滅類型判斷 為證實(shí)BSA與櫟癭酸相互作用時產(chǎn)生的熒光猝滅的特性，本研究利用Stern-Volmer方程進(jìn)行判斷，方程如下所示：

F0/F=1+KSV·[Q]=1+Kq·τ0[Q]

(1)

式中F0和F分別表示在加入熒光猝滅劑前后的內(nèi)源熒光發(fā)射強(qiáng)度；KSV為熒光基團(tuán)Stern-Volmer常量；[Q]為熒光猝滅劑濃度；Kq為熒光猝滅過程的猝滅速率常量，動態(tài)猝滅最大速率常量約等于2.0×1010L/mol/s[8]；τ0為熒光物質(zhì)中熒光基團(tuán)的平均熒光壽命，對蛋白質(zhì)分子來說約為10-8s[9]。取不同溫度下BSA自身熒光發(fā)射強(qiáng)度F0及加入不同濃度櫟癭酸后BSA的最大熒光發(fā)射強(qiáng)度F，以F0/F對櫟癭酸濃度[Q]做線性擬合，結(jié)果如圖2所示。由所得直線的斜率獲得不同溫度下的猝滅常數(shù)KSV以及猝滅速率常數(shù)Kq，結(jié)果匯總于表1。

圖2 不同溫度下櫟癭酸對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線

從表1中可以看出，伴隨著反應(yīng)溫度的上升，BSA與櫟癭酸結(jié)合過程中KSV持續(xù)下降，說明溫度升高并不利于二者的結(jié)合，因?yàn)闇囟壬哂欣趧討B(tài)猝滅的發(fā)生與發(fā)展，所以該猝滅過程不是由擴(kuò)散和碰撞所引起的動態(tài)猝滅。同時該反應(yīng)Kq均大于最大動態(tài)猝滅速率常量2×1010L·mol-1·s-1，所以BSA與櫟癭酸結(jié)合過程所產(chǎn)生的熒光猝滅是由于BSA與櫟癭酸生成了基態(tài)絡(luò)合物所引起的靜態(tài)猝滅。

表1 不同溫度下櫟癭酸對BSA的熒光猝滅常數(shù)KSV和猝滅速率常數(shù)Kq

3.3 BSA與櫟癭酸相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù) 對于靜態(tài)猝滅過程來說，熒光體的熒光強(qiáng)度與猝滅劑濃度之間符合以下公式[10]：

lg[(F0-F)/F)=lgKa+nlg[Q]

(2)

式中F0、F仍分別代表猝滅劑不存在以及存在時樣品體系的熒光強(qiáng)度；Ka指蛋白質(zhì)分子與小分子物質(zhì)之間的結(jié)合常數(shù)；n是蛋白質(zhì)分子與小分子物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。在不同溫度下，以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]做線性擬合，結(jié)果如圖3所示。由所得直線的斜率及截距即可獲得不同溫度下的結(jié)合常數(shù)Ka以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，結(jié)果匯總于表2。

圖3 不同溫度下櫟癭酸猝滅BSA的lg[(F0-F)/F]對lg[Q]圖■:288K，●:298K，▲:308K

從表2中可以看出，櫟癭酸對BSA熒光猝滅過程的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)介于0.8181～0.8149近乎于1，表明理論上每個BSA分子能夠結(jié)合一個櫟癭酸分子。同時伴隨反應(yīng)溫度的上升，BSA與櫟癭酸的結(jié)合常數(shù)由最初的3.242×103L·mol-1下降至1.620×103L·mol-1，同時結(jié)合位點(diǎn)數(shù)由0.8181下降至0.8149，可以看出溫度升高并不利于結(jié)合的進(jìn)行，這也從另一方面說明BSA與櫟癭酸的結(jié)合過程中形成了不穩(wěn)定的復(fù)合物，隨著實(shí)驗(yàn)溫度的增加，復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，二者之間發(fā)生的熒光猝滅現(xiàn)象屬于靜態(tài)猝滅過程。

表2 櫟癭酸對BSA熒光猝滅的結(jié)合常數(shù)Ka以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

3.4 BSA與櫟癭酸相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和作用力類型 根據(jù)Ross定律，本研究可利用蛋白質(zhì)與小分子配體反應(yīng)過程熱力學(xué)參數(shù)的變化即可確定蛋白質(zhì)分子與小分子配體之間的作用力類型：若反應(yīng)過程焓變ΔH>0，熵變ΔS>0，則二者之間作用力主要為為疏水作用力；若反應(yīng)過程ΔH<0，ΔS>0，則二者之間作用力主要為靜電作用力；若反應(yīng)過程ΔH<0，ΔS<0，則二者之間作用力主要為氫鍵和范德華力[11]。對于蛋白質(zhì)分子與小分子配體結(jié)合過程，其熱力學(xué)參數(shù)之間符合以下關(guān)系[12]：

lnKa=-ΔH/RT+ΔS/R，ΔG=ΔH-TΔS

(3)

式中Ka為不同溫度下二者之間的結(jié)合常數(shù)；氣體常數(shù)R=8.314 J/(K·mol)；T為反應(yīng)絕對溫度。以櫟癭酸與BSA在不同溫度下相互作用過程的lnKa對1/T作圖，由斜率與截距即可分別計算出二者結(jié)合過程的焓變ΔH以及熵變ΔS，進(jìn)一步即可得出結(jié)合反應(yīng)過程的吉布斯自由能變ΔG，結(jié)果匯總于表3。通過表中結(jié)果可以看出，不同溫度下吉布斯自由能變ΔG均小于零，說明BSA與櫟癭酸的相互作用是自發(fā)進(jìn)行的；ΔH<0和ΔS<0時，說明BSA與櫟癭酸之間相互作用力主要為氫鍵和范德華力，且整個過程是焓驅(qū)動占主導(dǎo)的。另外，ΔH<0說明二者的相互作用是一個放熱的過程。

表3 BSA與櫟癭酸結(jié)合過程的熱力學(xué)參數(shù)

3.5 BSA與櫟癭酸相互作用的能量轉(zhuǎn)移機(jī)制以及結(jié)合距離 Foster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論認(rèn)為[13-14]，當(dāng)供能體可發(fā)射熒光，且與受能體的結(jié)合距離小于等于7 nm，同時供能體熒光發(fā)射光譜與受能體吸收光譜有重疊時，能量可以非輻射能量轉(zhuǎn)移形式從供能體激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)移到能量受體。且非輻射能量轉(zhuǎn)移效率E、供能體與受能體之間的距離r及能量轉(zhuǎn)移效率為50%的臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0之間存在以下關(guān)系[15]：

(4)

式中，K2為偶極空間取向因子2/3；N為介質(zhì)折射指數(shù)1.336；φ為熒光供體的熒光量子產(chǎn)率0.118；J為熒光供體的熒光發(fā)射光譜與熒光受體的吸收光譜重疊積分，可由以下關(guān)系式獲得：

J=∑[(λ)ε(λ)λ4Δλ]/∑F(λ)Δλ，A=lg(1/D)=εbc

(5)

式(5)中F(λ)是熒光供體在波長λ處的熒光發(fā)射強(qiáng)度；ε(λ)是熒光受體在波長λ處的紫外摩爾吸光系數(shù)；A為熒光供體的紫外吸光度；D為其透射比；ε為紫外摩爾吸光系數(shù)；c為吸光物質(zhì)的濃度；b為吸光介質(zhì)的厚度。

圖4所示為BSA與櫟癭酸的光譜圖，由圖中可以看到，BSA的熒光發(fā)射光譜與櫟癭酸的紫外吸收譜有明顯重疊部分。利用光譜數(shù)據(jù)，通過式(4)、(5)計算即可得到BSA與櫟癭酸結(jié)合過程中的相關(guān)參數(shù)，結(jié)果匯總于表4。從表中可以看出BSA與櫟癭酸之間作用的平均距離為4.134 nm，同時說明二者之間確實(shí)發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移。

圖4 BSA熒光發(fā)射光譜與櫟癭酸吸收光譜

表4 BSA與櫟癭酸的結(jié)合距離信息

3.6 結(jié)合位置取代實(shí)驗(yàn) BSA分子上有兩個結(jié)合位點(diǎn)(Site Ⅰ和Site Ⅱ)，而華法林和布洛芬分別是這兩個結(jié)合位點(diǎn)的特異性標(biāo)志物[16-17]。因此，通過選用華法林和布洛芬作為不同結(jié)合位點(diǎn)的競爭劑，可獲得櫟癭酸的結(jié)合位點(diǎn)的相關(guān)信息。當(dāng)不存在、以及及分別存在競爭劑華法林、布洛芬的情況下，櫟癭酸與BSA結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的變化情況匯總于表5。由表5可知，在Site Ⅱ位點(diǎn)被布洛芬所占據(jù)時，櫟癭酸的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n以及結(jié)合常數(shù)Ka只有微弱的減少，說明藥物與標(biāo)志物之間不存在明顯的直接競爭作用；而在Site Ⅰ位點(diǎn)被標(biāo)志物布洛芬占據(jù)后，櫟癭酸的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Ka以及結(jié)合常數(shù)n均明顯降低，表明櫟癭酸與華法林之間發(fā)生直接競爭作用，即櫟癭酸與BSA作用的結(jié)合位點(diǎn)為Site Ⅰ位點(diǎn)。

表5 不同競爭劑存在下BSA與櫟癭酸的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及結(jié)合常數(shù)

3.7 BSA與櫟癭酸識別過程的構(gòu)象變化-同步熒光光譜光譜分析

圖5展示了BSA在與櫟癭酸結(jié)合過程中當(dāng)Δλ=60nm和Δλ=15nm的同步熒光光譜。從圖中可以看出，伴隨著加入的櫟癭酸濃度的增加，BSA在Δλ=60nm和Δλ=15nm時的同步熒光強(qiáng)度均發(fā)生了明顯改變，說明BSA分子中的酪氨酸、色氨酸殘基均參與了熒光猝滅過程，其中對色氨酸的猝滅效果更為明顯。同時我們注意到，伴隨著櫟癭酸濃度的增加，Δλ=15 nm時的同步熒光光譜的最大發(fā)射峰位并未發(fā)生明顯的改變，而當(dāng)Δλ=60 nm的同步熒光光譜則顯示出輕微藍(lán)移現(xiàn)象，說明在BSA與櫟癭酸的結(jié)合過程中，蛋白中酪氨酸殘基所處的微環(huán)境微環(huán)境沒有明顯的改變，而色氨酸殘基所處的微環(huán)境微環(huán)境疏水性略微增強(qiáng)。

圖5 BSA與櫟癭酸相互作用的同步熒光發(fā)射光譜.A: Δλ=60nm，B: Δλ=15nmC (Roburic acid，a-g):0×10-6、5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35 ×10-6 mol/L.

3.8 BSA與櫟癭酸識別過程的構(gòu)象變化—紅邊激發(fā)位移(REES)分析 紅邊激發(fā)位移是指當(dāng)溶劑介質(zhì)存在緩慢舒張作用時，色氨酸中吲哚環(huán)與臨近偶極子的電子結(jié)合作用即可引起色氨酸電子躍遷能分配的一種現(xiàn)象，是一種監(jiān)測熒光發(fā)色基團(tuán)微環(huán)境改變的方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)受到激發(fā)光照射時，若蛋白質(zhì)中色氨酸殘基所處微環(huán)境是流動的，則其在發(fā)射熒光之前就已經(jīng)出現(xiàn)了緩慢舒張作用，此時色氨酸殘基產(chǎn)生的熒光光譜的發(fā)射波長不發(fā)生變化。如果色氨酸殘基處在受限環(huán)境當(dāng)中，色氨酸中處于激發(fā)態(tài)的吲哚環(huán)將會產(chǎn)生緩慢舒張作用，并且激發(fā)波長不同，其發(fā)射波長也不同[18-19]。

在實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，在266 nm的激發(fā)波長下，BSA熒光發(fā)射光譜的最大發(fā)射波長位于346 nm，所以選取326(FL)和366(FR)這兩個等波長點(diǎn)進(jìn)行雙波長處理。由圖6可見，在相同激發(fā)波長下，BSA的FL/FR值伴隨著櫟癭酸濃度的增大而上升，說明伴隨著BSA與櫟癭酸反應(yīng)的進(jìn)行，熒光發(fā)射光譜發(fā)生藍(lán)移[18]，這也從另一方面驗(yàn)證“3.1”中得到的結(jié)果，即說明BSA結(jié)構(gòu)的疏水性伴隨著反應(yīng)的進(jìn)行而有所增加。

圖6 櫟癭酸對BSA紅邊激發(fā)熒光位移的影響，C(櫟癭酸a→e)：0×10-6、5×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6 mol/L

當(dāng)櫟癭酸濃度分別為0×10-6、5×10-6、15×10-6mol/L時，隨著激發(fā)波長的逐漸增大，BSA的FL/FR值緩慢降低，產(chǎn)生了Rees現(xiàn)象，說明在上述情況下，BSA中色氨酸殘基的運(yùn)動受到限制。然而，隨著體系中櫟癭酸濃度的擴(kuò)大，當(dāng)櫟癭酸濃度分別為20×10-6、25×10-6mol/L時，BSA的FL/FR值不再隨著激發(fā)波長的增大而明顯降低，即不再產(chǎn)生Rees現(xiàn)象，說明伴隨著櫟癭酸濃度的升高，由于BSA構(gòu)象的改變，分子中色氨酸殘基處于了相對流動的微環(huán)境當(dāng)中。

4 結(jié)論

本研究設(shè)計一種全面表征傳統(tǒng)藏藥中有效成分與功能蛋白相互作用與識別過程的實(shí)驗(yàn)方法。本研究以藏藥秦艽中有效成分櫟癭酸以及運(yùn)載蛋白為例，在不同溫度下利用本方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：櫟癭酸與BSA二者之間發(fā)生的結(jié)合作用引起了BSA內(nèi)源熒光猝滅，造成的猝滅現(xiàn)象為形成了不發(fā)熒光絡(luò)合物的靜態(tài)猝滅過程。通過測量可獲得二者在不同溫度下結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)以及結(jié)合過程中相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)，并得知二者相互結(jié)合是以氫鍵和范德華力為主要作用力的自發(fā)、放熱反應(yīng)過程。同時，二者結(jié)合過程中發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移，且櫟癭酸結(jié)合于BSA分子中的Site Ⅱ位點(diǎn)，平均結(jié)合距離為4.134 nm。另外，在二者識別過程中，BSA結(jié)構(gòu)的疏水性有輕微的增加，而且伴隨著櫟癭酸濃度的增加，BSA中色氨酸所處微環(huán)境疏水性有了輕微增加，微環(huán)境流動性逐步增強(qiáng)。