蘇 丹，唐 飛，張善明，陳玉瓊，倪德江

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，武漢 430070）

由于受飲食規(guī)律、飲食結(jié)構(gòu)、社會因素及心理因素的影響，越來越多人患有胃腸健康相關(guān)的疾病。胃腸道的健康尤其是腸道菌群的平衡影響機體營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、能量供應(yīng)、機體免疫等功能的運行，是影響人體健康的重要因素［1，2］。治療胃腸疾病的藥物雖然有一定的特效性，但長期服用易產(chǎn)生依賴性、抗藥性以及對肝臟易產(chǎn)生副作用等問題，因此尋求安全、有效、天然的“胃腸調(diào)節(jié)劑”是預(yù)防和治療相關(guān)疾病的新途徑。

青磚茶屬于六大基本茶類之一的黑茶，為后發(fā)酵茶，原產(chǎn)于湖北省赤壁市羊樓洞，歷史悠久，源于唐，盛于明清［3］。曬青毛茶經(jīng)渥堆發(fā)酵、干燥、再拼配、蒸壓成型、低溫長烘、陳化等工序加工成為青磚茶，優(yōu)質(zhì)的青磚茶香氣純正，有木香或菌香，滋味醇和，湯色紅（黃）橙明亮，葉底青褐［4］。青磚茶不僅可以生津解渴、利尿解毒、消臭除菌，還具有減脂、降血脂、抗氧化、改善腸道功能等生理功效［5-7］。長期飲用青磚茶可以一定程度上預(yù)防胃腸疾病。然而，由于茶樹對氟的吸收特性，茶葉的含氟量隨成熟度的增加而增加，以成熟新梢為原材料的青磚茶含氟量往往超過國家標(biāo)準(zhǔn)（0.3‰），高的達(dá)到0.8‰以上［8-10］，而長期多量飲用含氟量高的茶葉易導(dǎo)致人體內(nèi)氟元素過量而引發(fā)氟斑牙、氟骨癥等疾?。?1］。研究表明，除選用低氟茶樹品種［12］、改善栽培條件、改變加工方式［13］等方法外，還可以通過降低原料的成熟度［14］來降低青磚茶的含氟量，但有關(guān)青磚茶嫩度提高后是否影響其功能的研究較少。

改善腸道功能是青磚茶最為重要的活性之一。前期已經(jīng)就不同年份青磚茶［15］、不同發(fā)酵程度青磚茶［16］對小鼠胃腸道功能的改善作用進(jìn)行了研究，但仍缺乏不同嫩度青磚茶對改善胃腸道功能的研究。因此，本研究通過測定小鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率以及腸道菌群數(shù)量，研究了不同嫩度青磚茶對小鼠胃排空及小腸推動功能和腸道菌群的作用，并分析了青磚茶的生化成分與胃腸道功能的相關(guān)性，以探明嫩度對青磚茶改善腸道功能的影響，為創(chuàng)新青磚茶原料采收技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

恩施州宣恩縣伍臺昌臣茶業(yè)有限公司生產(chǎn)的曬青毛茶，嫩度為純單芽、一芽二三葉、一芽四五葉。渥堆試驗在人工氣候箱（RXZ-328A型）進(jìn)行，掌握渥堆葉含水量38%、溫度45℃、濕度85%、渥堆時間18 d。渥堆結(jié)束后在SKFG-01型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，得到單芽、一芽二三葉、一芽四五葉不同嫩度的青磚茶原料。

1.2 試驗動物

健康成年昆明種小鼠，體重（25±1）g，SPF級，由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。

1.3 藥品及試劑

營養(yǎng)性半固體糊的制備：10 g羧甲基纖維素鈉加16 g奶粉、8 g蔗糖、8 g淀粉、5 g活性炭溶解于250 mL蒸餾水中攪拌均勻制成300 mL（約300 g）半固體糊狀物，冰箱冷藏，使用前2 h取出，恢復(fù)至室溫。腸道菌群培養(yǎng)基及廠家如表1所示。

表1 腸道菌群培養(yǎng)基及廠家

1.4 主要設(shè)備

AW220型電子分析天平、RXZ-328A型人工氣候箱、SKFG-01型鼓風(fēng)干燥箱、巨輪牌FZ102型植物粉碎機、SW-CJ-2FD型超凈工作臺、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋、DNP系列電熱恒溫培養(yǎng)箱、厭氧盒、高壓滅菌鍋、常規(guī)玻璃儀器等。

1.5 方法

1.5.1 不同嫩度青磚茶水提物的主要化學(xué)成分測定 茶多酚總量采用福林酚法［17］，兒茶素組分、咖啡堿、有機酸含量采用高效液相色譜法（HPLC），氨基酸總量檢測采用茚三酮顯色法［18］，水浸出物含量采用重量法［19］，可溶性糖含量采用蒽酮比色法［20］，茶黃素、茶紅素和茶褐素含量采用系統(tǒng)法［21，22］。所有試驗重復(fù)3次。

兒茶素組分及咖啡堿含量檢測的HPLC條件：用70%甲醇溶解在70℃水浴中浸提樣品10 min，3 000 r/min離心10 min，過0.45 μm濾膜后待測。HPLC條件：LC1200，Agilent，USA；色譜柱，Agilent TC-C18（4.6 μm×250 mm）；進(jìn)樣量5 μL；流速1 mL/min；溫度35℃；檢測波長280 nm；流動相A，超純水（0.1%甲酸）；流動相B，甲醇（0.1%甲酸）；梯度洗脫條件，0～10 min，100% A；10～20 min，68% A和32% B；20～30 min，100%A。

有機酸組分含量檢測的HPLC條件：用蒸餾水在100℃水浴中浸提20 min，脫脂棉過濾，用微孔濾膜過濾。色譜柱：AgilentHB-C18，色譜條件：柱溫30℃；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長：210 nm；流動相A：KH2PO4，流動相B：甲醇；梯度洗脫條件，0～5 min，99% A，1%B；5～25 min，97%A，3%B；25～30 min，99%A，1%B。

1.5.2 青磚茶水提物的制備 取青磚茶茶粉，以茶水比1∶15微沸提取30 min，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，分別配制成不同嫩度青磚茶茶湯。

1.5.3 青磚茶水提物劑量的選擇 參考黑茶吸收試驗，人體推薦量為每人10 g/d（成人60 kg），試驗設(shè)計劑量為人體推薦量的10倍（1 667 mg/kg）［23］，另設(shè)正常對照組給予等體積蒸餾水。

1.5.4 不同嫩度青磚茶對正常小鼠胃排空和小腸推進(jìn)功能的影響 小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)4 d后，開始正式試驗。取健康小鼠40只，全為雄性，隨機分為正常對照組、單芽組、一芽二三葉組、一芽四五葉組，每組10只。每組按每只0.15 mL/10 g分別灌胃，1次/d，青磚茶水提物連續(xù)給15 d；正常對照組灌胃等體積的蒸餾水。末次灌胃前24 h，小鼠禁食不禁水。第15天給予青磚茶水提物后30 min，每只小鼠灌胃5%的炭末混懸液（用l%的羧甲基纖維素鈉配制）0.8 mL。灌營養(yǎng)性半固體糊25 min后，小鼠脫頸椎處死，取胃，濾紙拭干后稱全重，沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內(nèi)容物后拭干稱胃凈重。胃全重和胃凈重的差值為胃殘留物重，以此與所灌半固體糊的重量百分比為胃內(nèi)殘留率（%）。迅速取出小鼠的胃及回盲腸部位的整段小腸，剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管，輕輕剝離后不加牽引直鋪于白紙上，鋪直后測量幽門至炭末前沿的距離，以幽門至炭末前沿的距離占幽門至回盲部全長的百分率為炭末推進(jìn)百分率（%）。

胃內(nèi)容物殘留率=（胃全重-胃凈重）/半固體糊重×100%

炭末推進(jìn)百分率=（炭末移動距離/腸總長度）×100%

1.5.5 不同嫩度青磚茶對正常小鼠腸道菌群的影響 無菌采集小鼠新鮮糞便0.1～0.4 g，置于己稱重的干燥滅菌小試管（編號為10-1）中，充分振蕩，直至糞便分散均勻，再依次10倍稀釋至10-9，4 h內(nèi)完成。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，選擇合適的稀釋度，分別取1 mL接種到各類選擇性培養(yǎng)基上，3個重復(fù)。EMB培養(yǎng)基和膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂培養(yǎng)基放入37℃需氧培 養(yǎng)24～48 h后 計 數(shù)，BBL培 養(yǎng) 基 及MRS培 養(yǎng) 基37℃厭氧培養(yǎng)24～48 h后計數(shù)。根據(jù)菌落形態(tài)，涂片分析計算各菌群每克糞便中菌落形成數(shù)，結(jié)果以對數(shù)表示（lgCFU/g）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010和SPSS 18.0軟件統(tǒng)計處理分析。SPSS 18.0試驗數(shù)據(jù)用（x±s）表示，采用單因素方差分析，組間用兩兩比較差異法，同列不同大小寫字母分別表示在0.01、0.05水平差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同嫩度青磚茶主要品質(zhì)成分測定結(jié)果

青磚茶主要生化成分含量因毛茶原料的嫩度不同而具有一定的差異。由表2可知，單芽青磚茶的游離氨基酸含量、茶多酚含量最高，與一芽二三葉、一芽四五葉青磚茶存在極顯著差異（P＜0.01），而其茶褐素含量與一芽四五葉青磚茶差異極顯著（P＜0.01），與一芽二三葉青磚茶無顯著差異。一芽二三葉青磚茶的可溶性糖、水浸出物、茶黃素、茶紅素含量最高，極顯著高于單芽青磚茶和一芽四五葉青磚茶（P＜0.01）。

表2 不同嫩度青磚茶水提物的主要化學(xué)成分測定結(jié)果

由表3可知，兒茶素組分和咖啡堿含量在不同嫩度青磚茶中均存在差異。在3種不同嫩度青磚茶中均未檢出GC和GCG，在一芽四五葉青磚茶中均未檢出C、ECG、EC，在單芽青磚茶中未檢出CG。一芽二三葉青磚茶的EGCG、C、ECG、EC含量均高于單芽青磚茶和一芽四五葉青磚茶，而一芽四五葉青磚茶的CG含量高于一芽二三葉青磚茶。隨青磚茶原料成熟度增加，EGC含量極顯著增加，咖啡堿含量極顯著減少。

表3 不同嫩度青磚茶兒茶素和咖啡堿含量測定結(jié)果 （單位：mg/g）

由表4可知，有機酸組分及其含量在不同嫩度的青磚茶中均存在差異。在3種不同嫩度青磚茶中均未檢出酒石酸、α-酮戊二酸、乙酸，在一芽四五葉青磚茶中富馬酸、琥珀酸也未檢出。單芽青磚茶的奎寧酸、乳酸、檸檬酸、沒食子酸、富馬酸含量最高，且前4種有機酸含量與其他嫩度青磚茶具有極顯著差異（P＜0.01），一芽二三葉青磚茶的草酸、琥珀酸含量最高，一芽四五葉青磚茶的蘋果酸含量最高。

表4 不同嫩度青磚茶有機酸組分含量測定結(jié)果 （單位：mg/g）

2.2 不同嫩度青磚茶水提物對小鼠胃排空的影響

由表5可見，在給予小鼠連續(xù)灌胃不同嫩度青磚茶水提物15 d后，小鼠的胃排空能力發(fā)生了明顯變化。與正常對照組比較，單芽組、一芽二三葉組和一芽四五葉組胃內(nèi)容殘留率分別減少了26.37%、23.02%、9.58%。從不同嫩度組間差異來看，單芽組與一芽二三葉組差異不顯著，與一芽四五葉青磚茶差異顯著（P＜0.05），而空白對照組和一芽四五葉組差異不顯著。結(jié)果表明，不同嫩度青磚茶均能降低胃殘留率，促進(jìn)小鼠胃排空作用，以單芽青磚茶的效果最佳。

表5 不同嫩度青磚茶水提物對小鼠胃排空的影響

2.3 不同嫩度青磚茶水提物對小鼠小腸推進(jìn)的影響

由表6可見，在給予小鼠連續(xù)灌胃不同嫩度青磚茶水提物15 d后，小鼠的小腸推進(jìn)能力發(fā)生了明顯變化。與空白對照組相比較，單芽組、一芽二三葉組、一芽四五葉組小腸推進(jìn)率均顯著提高，分別提高了56.73%、37.47%、30.72%。從不同嫩度組間差異來看，單芽組與一芽二三葉組、一芽四五葉組有顯著性差異，而一芽二三葉組和一芽四五葉組無明顯差異。結(jié)果表明，單芽、一芽二三葉、一芽四五葉青磚茶均能提高小腸推進(jìn)率，顯著促進(jìn)小腸的蠕動作用，且以單芽青磚茶效果最好。

表6 不同嫩度青磚茶水提物對小鼠小腸推進(jìn)的影響

2.4 不同嫩度青磚茶調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群作用的影響

由表7可見，在連續(xù)給予小鼠不同嫩度青磚茶15 d后，小鼠腸道內(nèi)的腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量均發(fā)生了明顯變化。與空白對照組相比，單芽、一芽二三葉、一芽四五葉青磚茶均對小鼠腸道內(nèi)腸桿菌、腸球菌的生長繁殖功能有明顯的抑制作用，對小鼠腸道內(nèi)乳桿菌、雙歧桿菌的生長繁殖功能有顯著的促進(jìn)作用，且兩種作用均以單芽青磚茶的效果最好。

表7 不同嫩度青磚茶對小鼠腸道菌群數(shù)量的影響 （單位：lgCFU/g）

2.5 不同嫩度青磚茶主要理化成分與小鼠胃腸道功能相關(guān)性分析

如表8所示，小鼠胃殘留率、腸桿菌、腸球菌與不同嫩度青磚茶游離氨基酸、茶多酚、茶褐素、咖啡堿、奎寧酸、乳酸、檸檬酸、沒食子酸、有機酸總量極顯著負(fù)相關(guān)，而與蘋果酸、EGC顯著正相關(guān)；小鼠小腸推進(jìn)率、乳桿菌、雙歧桿菌與不同嫩度青磚茶氨基酸、茶多酚、茶褐素、咖啡堿、奎寧酸、乳酸、檸檬酸、沒食子酸極顯著正相關(guān)，與蘋果酸、EGC顯著負(fù)相關(guān)；可溶性糖、水浸出物、茶黃素、茶紅素、茶褐素、EGCG、兒茶素總量、草酸等與小鼠胃腸道功能各指標(biāo)參數(shù)均無相關(guān)性。

表8 不同嫩度青磚茶主要理化成分與小鼠胃腸道功能相關(guān)性分析

3 討論

人類消化系統(tǒng)中含有龐大的正常菌群，菌群的組成十分復(fù)雜，有高達(dá)1 000多種不同類型的細(xì)菌及其他微生物群落。除了常見的胃腸道疾病，受人類腸道微生物菌群的直接或間接影響而發(fā)生的疾病有：Ⅱ型糖尿病、動脈硬化、肥胖癥、骨質(zhì)疏松、腫瘤、自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、精神疾病、癌癥等［24］?？梢娔c道菌群與人體之間的關(guān)系錯綜復(fù)雜，貫穿于人體各種生理活動和病理過程，已成為人體不可或缺的一部分，腸道健康深刻影響著人體的健康。青磚茶被證明具有抑制腸道內(nèi)有害菌的增殖、調(diào)節(jié)腸道菌群和調(diào)整腸道紊亂的作用［2］，可作為天然的胃腸調(diào)節(jié)劑。

不同嫩度的青磚茶因為生化成分的組成和含量不同，對小鼠胃腸功能的影響也不同。從胃排空、腸推進(jìn)試驗中發(fā)現(xiàn)，3種嫩度的青磚茶均能促進(jìn)胃排空和腸推進(jìn)，以單芽青磚茶的效果最好；從灌胃小鼠青磚茶水提物前后的四大類微生物菌群變化情況中發(fā)現(xiàn)，3種嫩度的青磚茶均能促進(jìn)有益菌雙歧桿菌、乳桿菌的增殖，抑制有害菌腸桿菌和腸球菌的增殖，且以促進(jìn)雙歧桿菌和抑制腸桿菌效果尤為顯著，以單芽青磚茶的效果最好，與胃排空試驗和小腸推進(jìn)試驗結(jié)果基本保持一致。結(jié)果表明，青磚茶對小鼠胃腸功能的影響與原料嫩度有關(guān)，原料越嫩，改善小鼠胃腸道功能效果越好，以單芽青磚茶效果最好。

青磚茶的生化成分組成與原料嫩度、微生物［2，25］有關(guān)，不同的有效成分均會對胃腸功能的調(diào)節(jié)作用造成影響。李鵬等［26］通過給仔豬飼喂常規(guī)日糧（對照組）、添加0.1%磷酸型酸化劑A、0.3%磷酸型酸化劑A、0.1%乳酸型酸化劑B和0.3%乳酸型酸化劑B日糧，測定大腸微生物菌群。結(jié)果表明，添加磷酸型酸化劑A和乳酸型酸化劑B都可以顯著降低仔豬盲腸大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量（P＜0.05），增加乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量（P＜0.05）。吳根梁等［27］將從陳放1年和7年的茯磚茶中提取純化的茶多酚提取物加入到含有65歲老年人的腸道菌群混合培養(yǎng)基中進(jìn)行體外靜態(tài)厭氧培養(yǎng)，測定茶多酚和短鏈脂肪酸（SCFAs）的含量，并進(jìn)行腸道菌群的高通量測序，對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，表明7年陳茯磚茶的茶多酚類比1年陳茯磚茶的茶多酚類更有益于改善老年人的腸道菌群結(jié)構(gòu)。結(jié)合不同嫩度青磚茶生化結(jié)果及其與胃腸功能指標(biāo)的相關(guān)性分析，可以初步推測青磚茶的調(diào)理腸胃功能成分可能是游離氨基酸、茶多酚總量、咖啡堿、茶褐素［28］、奎寧酸、乳酸、檸檬酸、沒食子酸［29］，還有微生物的參與并起到獨特作用。

適當(dāng)提高原料嫩度不僅不會影響青磚茶改善小鼠胃腸道的功能，而且能降低氟含量。