孟 薇，張 蕾，黃金海

（天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072）

流行性感冒是由流感病毒感染引起的一種急性呼吸道傳染性疾病，嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物健康［1］。疫苗接種是預(yù)防和控制流感病毒感染的最有效且經(jīng)濟(jì)的措施［2］。世界衛(wèi)生組織流感中心每年都會(huì)針對(duì)流感病毒的流行狀況預(yù)測(cè)下一年的流行毒株，將其作為疫苗候選毒株。抗原漂移是流感疫苗需要每年更新的主要原因［3］，對(duì)疫苗的開(kāi)發(fā)和疾病的防控形成重大挑戰(zhàn)。目前，使用的季節(jié)性流感疫苗只對(duì)與疫苗毒株相同或高度相似的流感病毒毒株具有預(yù)防和保護(hù)效力［4］，當(dāng)流行毒株與疫苗毒株不匹配時(shí)，季節(jié)性流感疫苗無(wú)法預(yù)防不同亞型流感病毒引起的流感，導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率顯著增加，嚴(yán)重時(shí)甚至發(fā)生流感大流行。因此，迫切需要研發(fā)一種廣譜的可抵御不同亞型的流感病毒通用疫苗，該疫苗可對(duì)不同流感病毒毒株和亞型提供廣泛的保護(hù)，解決流感病毒的快速傳播。本研究簡(jiǎn)要介紹目前存在的通用疫苗的分類并基于血凝素HA的通用疫苗研究進(jìn)展，以期為這方面研究提供參考。

1 血凝素的結(jié)構(gòu)與功能

血凝素（Hemagglutinin，HA）蛋白是甲型流感病毒的主要囊膜表面的主要糖蛋白，也是目前研究最深入的流感病毒相關(guān)蛋白，可與紅細(xì)胞受體結(jié)合導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集，具有免疫原性，與宿主細(xì)胞表面的受體的特異性結(jié)合有關(guān)，在流感病毒入侵感染過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。HA蛋白是1個(gè)以三聚體形式存在于類脂膜上的蛋白，在結(jié)構(gòu)上含有信號(hào)肽、跨膜區(qū)、胞漿區(qū)和胞外域4個(gè)結(jié)構(gòu)域［5，6］。3個(gè)HA單體（HA0）以非共價(jià)鍵的形式結(jié)合成為同源三聚體，存在于病毒包膜上面。HA單體可被蛋白酶裂解成為HA1和HA2兩條鏈，HA1和HA2以二硫鍵相連。每個(gè)HA單體由球狀頭部區(qū)域和桿狀莖部區(qū)域兩部分組成。球狀頭部由HA1組成，含有抗原決定簇和受體結(jié)合位點(diǎn)（Receptor binding site，RBS），并在分子表面暴露，呈口袋狀，是流感病毒感染復(fù)制的一種必需蛋白，是中和抗體的結(jié)合靶點(diǎn)［7］。因此，HA頭部是用于疫苗研制的重要靶抗原。HA蛋白莖部由HA2和部分HA1殘基組成，HA2亞基N端有一段高度疏水的區(qū)域，相對(duì)保守，與病毒囊膜相連，由α螺旋通過(guò)疏水作用穩(wěn)定三聚體的結(jié)構(gòu)［8］。

HA蛋白在與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合、膜融合、病毒顆粒包裝結(jié)合和病毒粒子致病性等多方面都發(fā)揮著重要作用［9］。在病毒感染過(guò)程中，HA蛋白前體HA0成熟組裝成三聚體，運(yùn)輸?shù)剿拗骷?xì)胞表面，在宿主蛋白酶的作用下，裂解生成HA1和HA2 2個(gè)亞單位［10，11］。HA1蛋白通過(guò)與宿主細(xì)胞表面的糖蛋白結(jié)合，使病毒顆粒附著在宿主細(xì)胞表面，再通過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞［12］；HA2蛋白N端的疏水性區(qū)域肽鏈暴露，在內(nèi)吞泡呈酸性環(huán)境的條件下發(fā)生構(gòu)象重排，從而病毒包膜與內(nèi)吞泡膜融合，并釋放病毒核糖核蛋白復(fù)合物到細(xì)胞質(zhì)中［13-15］。在受體親和力方面，不同亞型的HA蛋白對(duì)不同宿主細(xì)胞表面受體具有的親和力不同，影響不同的宿主。該蛋白可以特異性地識(shí)別N-乙?；僖核峄耐僖核峁烟牵⒁驭?2，6糖苷鍵形式或α-2，3糖苷鍵形式結(jié)合宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體，從而啟動(dòng)流感病毒感染過(guò)程［16］。研究發(fā)現(xiàn)，禽流感病毒主要通過(guò)α-2，3糖苷鍵形式與唾液酸受體結(jié)合，而人呼吸道上皮細(xì)胞表面的唾液酸主要以α-2，6糖苷鍵相連［17］。豬的呼吸道上皮細(xì)胞既分布了α-2，6唾液酸受體，又分布著部分α-2，3唾液酸受體，這說(shuō)明豬能同時(shí)感染禽流感和人流感，病毒較易發(fā)生跨種傳播［18］。在致病性方面，HA分子的切割位點(diǎn)處連續(xù)存在的堿性氨基酸是判斷流感病毒致病性的一個(gè)重要分子標(biāo)志，HA1蛋白部分氨基酸突變會(huì)對(duì)流感病毒的致病性產(chǎn)生較大影響［19，20］。

血凝素蛋白作為流感病毒的一個(gè)主要保護(hù)性抗原，能夠通過(guò)刺激機(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)的中和性抗體來(lái)達(dá)到中和病毒感染的目的［21］。HA頭部含有大量的抗原表位區(qū)域，莖部的保守區(qū)域含有幾種廣泛中和抗體的靶點(diǎn)，兩者具有廣譜中和多種甲型流感病毒亞型的能力。因此，甲型流感病毒HA蛋白頭部區(qū)域抗原表位和莖部區(qū)域抗原表位是研究抗體中和病毒感染機(jī)制、疫苗開(kāi)發(fā)的非常重要且有吸引力的靶點(diǎn)。

2 通用流感疫苗分類

目前，預(yù)防甲型流感病毒的主要手段就是接種疫苗，其中接種滅活疫苗和亞單位疫苗仍是抵抗季節(jié)性流感病毒最有效的2種方式。由于流感病毒抗原變異速度較快，上一年的疫苗通常不能對(duì)這一年的流感病毒起到保護(hù)作用，接種者不能在新一年獲得對(duì)當(dāng)年新型流感病毒的抵抗力，因此，科學(xué)家們?cè)谂﹂_(kāi)發(fā)一種通用流感疫苗，即一種能夠預(yù)防大部分甚至所有亞型流感病毒毒株，保護(hù)機(jī)體免受病毒感染的疫苗。目前，通用流感疫苗的研究工作旨在誘導(dǎo)對(duì)流感病毒表面蛋白或內(nèi)部蛋白高度保守區(qū)域的廣泛保護(hù)性免疫，主要靶向?yàn)榱鞲胁《颈砻嫣堑鞍譎A和NA、基質(zhì)蛋白M2及T細(xì)胞免疫等［22］。

2.1 基于NA蛋白的通用流感疫苗

NA蛋白是甲型流感病毒的另一個(gè)主要表面糖蛋白，與病毒粒子的釋放密切相關(guān)。抗NA的抗體雖然不具有病毒中和作用，但可以抑制NA的活性，降低病毒滴度，是研究新型流感疫苗的一個(gè)重要靶點(diǎn)［23］。為了評(píng)估流感病毒NA作為疫苗抗原的交叉保護(hù)潛力，Kim等［24］制備N1-VLP疫苗免疫小鼠后檢測(cè)到NA抑制活性，再用H1N1、H5N1和H3N2 3種毒株攻擊小鼠，表明N1-NLP疫苗具有保護(hù)小鼠免受流感病毒感染的潛力。在乙型流感病毒NA免疫試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了該現(xiàn)象，且當(dāng)受到維多利亞系乙型流感病毒的致死性攻擊時(shí)，該疫苗可保護(hù)小鼠免于發(fā)病和死亡［25］。

2.2 基于M2蛋白的通用流感疫苗

流感病毒基質(zhì)蛋白M2通過(guò)其離子通道活性調(diào)節(jié)pH，在內(nèi)吞過(guò)程中促進(jìn)基質(zhì)蛋白M1從核糖核蛋白復(fù)合物中解離［26，27］。早期通用流感疫苗的研究主要針對(duì)高度保守的流感病毒基質(zhì)蛋白M2的胞外域M2e［28-31］。目前，研究已經(jīng)證明小鼠血清中的特異性M2e抗體可以保護(hù)BALB/c小鼠抵抗同種類型的流感病毒的攻擊［32-34］。與未免疫組相比，免疫了M2e的小鼠在流感病毒攻擊后存活率提高約60%［35］，并激活了特異性T細(xì)胞免疫［36，37］。同時(shí)，在異源亞型流感病毒的攻擊后，M2e-VLP疫苗通過(guò)降低機(jī)體肺部病毒滴度和降低小鼠體重減輕程度來(lái)達(dá)到顯著交叉保護(hù)作用［38，39］。因此，基于M2e蛋白的疫苗研究也是一種新型流感通用疫苗研究策略。

2.3 基于T細(xì)胞免疫的通用流感疫苗

機(jī)體對(duì)流感病毒的免疫反應(yīng)是由先天性免疫和適應(yīng)性免疫共同控制的。先天性免疫限制最初的病毒復(fù)制，是非特異性的；只有強(qiáng)大的適應(yīng)性免疫才能有效清除流感病毒，激活體液免疫和細(xì)胞免疫。常規(guī)的流感疫苗旨在誘導(dǎo)對(duì)流感病毒的體液免疫，由于病毒抗原變異的發(fā)生，這些疫苗并不完全具有保護(hù)作用?？茖W(xué)家們近幾年發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞反應(yīng)可能在預(yù)防流感病毒感染中具有關(guān)鍵作用［40-45］，CD8+細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）可介導(dǎo)病毒清除并且已顯示出對(duì)不同亞型流感病毒具有交叉反應(yīng)性免疫作用［46-49］。目前，研究人員正在探索主要刺激流感特異性T細(xì)胞免疫的疫苗［50，51］，作為提高流感疫苗效力和開(kāi)發(fā)通用流感疫苗的一種途徑，大部分疫苗選擇靶向保守的流感病毒內(nèi)部蛋白或其他高度保守的可刺激T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的抗原決定簇。Valkenburg等［52］研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)了H5N1亞型流感病毒的HA、NA、M1、M2和NP蛋白的T細(xì)胞表位肽的重組疫苗免疫小鼠后，該疫苗可保護(hù)小鼠抵抗來(lái)自同源或異源流感病毒的攻擊。將流感特異性CD4+T細(xì)胞耗竭后再進(jìn)行疫苗接種，病毒攻擊后小鼠的存活率降低，說(shuō)明該疫苗介導(dǎo)的保護(hù)作用依賴于流感特異性CD4+T細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)開(kāi)發(fā)和優(yōu)化T細(xì)胞活化疫苗具有重要意義。

3 靶向流感病毒HA的通用疫苗的研究進(jìn)展

除了上述介紹的幾種靶點(diǎn)通用疫苗，目前深入的廣譜疫苗主要是基于甲型流感病毒血凝素HA的通用疫苗，可分為無(wú)頭HA疫苗、嵌合疫苗、計(jì)算優(yōu)化抗原（COBRA）疫苗、病毒樣顆粒（VLP）疫苗和馬賽克疫苗等［53，54］，如圖1所示。

圖1 基于血凝素HA的通用流感疫苗研究分類

3.1 基于無(wú)頭HA的通用疫苗的研究進(jìn)展

由于HA頭部易發(fā)生突變?cè)斐煽乖?，而莖部的結(jié)構(gòu)和序列在不同亞型間高度保守，可以產(chǎn)生廣泛的免疫反應(yīng)［55］，能夠克服抗原漂移，因此研究人員嘗試去掉流感病毒HA蛋白的頭部，將HA蛋白的莖部作為通用疫苗的候選區(qū)域。Sagawa等［56］用分別過(guò)表達(dá)無(wú)頭（Headless）HA和全長(zhǎng)HA的細(xì)胞免疫小鼠，用甲型H1N1流感病毒攻擊后，Headless HA組免疫的小鼠的存活率大于對(duì)照組，即說(shuō)明HA莖部有一定的免疫抗性。John等［57］將流感病毒HA莖部的保守性區(qū)域制備疫苗免疫小鼠并設(shè)計(jì)攻毒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)盡管HA莖部構(gòu)象不完整，不能產(chǎn)生中和抗體，但靶向HA莖部的抗體能夠阻止HA蛋白水解，抑制病毒與細(xì)胞膜融合，延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間，從而加快機(jī)體清除病毒能力，保護(hù)小鼠免受甲型H1N1、H5N1和H6N1病毒的致死性攻擊，且當(dāng)小鼠存在預(yù)存免疫力時(shí)，觀察到的保護(hù)作用增強(qiáng)。張立霞等［58］利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，將Headless HA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HA能夠表達(dá)但不能使紅細(xì)胞發(fā)生凝集。Park等［59］評(píng)估了受試志愿者在病毒攻擊前后體內(nèi)的抗HA莖部抗體的滴度及其對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用，表明抗HA莖部抗體在人類流感疫苗研發(fā)過(guò)程中可作為新型疫苗起作用。

3.2 基于HA的嵌合疫苗的研究進(jìn)展

3.2.1 嵌合HA疫苗 制備嵌合HA疫苗是另一種提高HA莖部區(qū)域抗原性的方法，即表達(dá)了一種亞型流感病毒的HA頭部區(qū)域和另一種亞型流感病毒HA的頭部或莖部區(qū)域制備的疫苗［60-62］，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)季節(jié)性流感的廣泛性抗體［63，64］。早期的HA嵌合疫苗是將編碼2種亞型流感病毒的HA1克隆至同一載體上制備的DNA嵌合疫苗。王芙艷［65］將編碼A、B兩種亞型流感病毒HA1基因構(gòu)建到表達(dá)載體pCAGGSP7上并免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)該嵌合HA疫苗可同時(shí)產(chǎn)生針對(duì)2種亞型的特異性抗體，并可保護(hù)小鼠抵抗流感病毒的致死性攻擊，提供交叉保護(hù)作用。Krammer等［45］將表達(dá)了H9亞型HA蛋白頭部序列和H1亞型HA蛋白莖部序列的嵌合疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生針對(duì)HA莖部的廣譜中和抗體，且對(duì)同組類型流感病毒毒株的攻擊起到保護(hù)作用。Nachbagauer等［66］還將表達(dá)了H8亞型HA頭部序列、H1亞型HA莖部序列和N1亞型的NA序列的質(zhì)粒制備的嵌合疫苗免疫雪貂，同時(shí)免疫2種季節(jié)性流感疫苗作為對(duì)照，也發(fā)現(xiàn)了相比于季節(jié)性流感疫苗，嵌合疫苗提供的交叉保護(hù)作用更強(qiáng)。嵌合疫苗是新型流感疫苗研發(fā)的流行趨勢(shì)之一，優(yōu)勢(shì)之處在于嵌合疫苗可應(yīng)對(duì)最新一年的流感毒株，在疫苗制備過(guò)程中只需將最新一年的流感病毒HA頭部替換以往的有效嵌合疫苗中的HA部分，即可制備交叉保護(hù)性較高的廣譜性疫苗；除了HA頭莖部嵌合疫苗外，還可以將流感病毒HA與其他致病性毒株的主要保護(hù)性抗原結(jié)合起來(lái)，起到預(yù)防2種病原體感染的作用。

3.2.2 馬賽克HA疫苗 馬賽克疫苗是在嵌合疫苗基礎(chǔ)上擴(kuò)展的疫苗，是廣譜疫苗研究的熱點(diǎn)之一［67］。該疫苗設(shè)計(jì)依托于HIV馬賽克疫苗設(shè)計(jì)原理［68］，即將流感多種抗原（基因片段）組合在一起，形成對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有較強(qiáng)刺激作用并能生成有效抗體的疫苗。2014年Kamlangdee等［69］首次將2 145株H5N1流感病毒毒株分離并分析抗原表位后制得馬賽克疫苗，該疫苗不僅可保護(hù)小鼠抵抗H5亞型流感病毒致死性攻擊，還可抵抗季節(jié)性流感H1N1的攻擊，起到了廣泛的交叉保護(hù)作用。Broecker等［70］研究發(fā)現(xiàn)，馬賽克疫苗免疫小鼠和雪貂后，機(jī)體可以產(chǎn)生頭部特異性抗體，且產(chǎn)生的抗體水平要大于季節(jié)性流感疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體水平，能夠誘導(dǎo)出更高的HI滴度。Kanekiyo等［71］將來(lái)自多種菌株蛋白的受體結(jié)合區(qū)域RBD展示在納米粒子表面制備馬賽克疫苗，與不同亞型單個(gè)菌株RBD展示納米粒子制備的嵌合疫苗混合物相比，馬賽克疫苗產(chǎn)生的中和性抗體更多，且抗體反應(yīng)更廣泛?；贖A的馬賽克疫苗研究為流感通用疫苗的研究提供了新的思路和方法，雖然目前研究成果與真正意義上的、有效的臨床應(yīng)用疫苗相距甚遠(yuǎn)，但具有重要的參考意義和應(yīng)用價(jià)值。

3.3 基于HA的VLP疫苗的研究進(jìn)展

重組流感病毒樣顆粒（VLP）指由多個(gè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白組成但不包含病毒基因組，可通過(guò)外源表達(dá)并純化的非傳染性病毒顆粒，具有免疫原性和生物學(xué)活性，目前已被證明可刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng)并誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)不同種流感病毒的保護(hù)性抗體［72］。Galarza等［73］分析了1918年大流行流感病毒毒株VLPs的組成和三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)HA分子莖部區(qū)域均勻地分布在VLP表面，HA構(gòu)象處于預(yù)融合狀態(tài)，可以產(chǎn)生靶向HA莖部的特異性抗體。血凝試驗(yàn)顯示共表達(dá)HA、NA、M1、M2這4種蛋白的病毒樣顆粒具有凝集雞紅細(xì)胞的活性，且制備的VLPs免疫小鼠產(chǎn)生的抗體能保護(hù)小鼠免受致死性流感病毒的攻擊［74］，即說(shuō)明VLP疫苗具有抗原保護(hù)作用，是一種新興疫苗研發(fā)策略。除此之外，H1亞型、H3亞型、H5亞型和H7亞型流感病毒HA蛋白制備的VLPs免疫小鼠后，也可保護(hù)小鼠機(jī)體免受來(lái)自同源或H2、H6、H10和H11等異種亞型流感病毒毒株的致死性攻擊［75］，說(shuō)明該VLP疫苗還具有交叉保護(hù)作用。在2009年墨西哥流感爆發(fā)前提下的健康人類試驗(yàn)中，還發(fā)現(xiàn)了VLP疫苗可在較短時(shí)間內(nèi)刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，兩劑便具有高血清保護(hù)率［76］，由于其高的安全性和免疫原性，基于HA的VLP疫苗的研究為通用流感疫苗的開(kāi)發(fā)提供了一種新的可能。

3.4 基于HA的COBRA疫苗的研究進(jìn)展

COBRA疫苗即通過(guò)計(jì)算方式優(yōu)化的HA多肽疫苗，通過(guò)一系列的HA蛋白比對(duì)和隨后共有序列的產(chǎn)生來(lái)研發(fā)優(yōu)化的HA多肽，可以引起針對(duì)流感病毒的廣泛反應(yīng)性免疫應(yīng)答［77，78］。研究人員分析了2004—2006年Clade 2分支H5N1流感病毒所有HA蛋白序列并篩選出最保守的氨基酸位點(diǎn)并合成COBRA HA序列，制備的COBRA-VLP疫苗免疫小鼠和雪貂后發(fā)現(xiàn)血清中具有較高的HI抗體滴度［79］，且與單個(gè)亞型的HA VLP混合物疫苗相比，COBRA疫苗可保護(hù)小鼠和雪貂免受同組不同亞型流感病毒的致死性攻擊［80］。在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型食蟹猴中也觀察到該現(xiàn)象，同時(shí)還可保護(hù)機(jī)體，降低炎癥反應(yīng)的發(fā)生［81］。此外，研究發(fā)現(xiàn)在COBRA疫苗中添加油乳劑可提高疫苗產(chǎn)生抗體反應(yīng)的強(qiáng)度和廣度，更大范圍地產(chǎn)生特異性抗體［80］。同時(shí)，由于COBRA疫苗在研發(fā)制備過(guò)程中分析了蛋白序列，研究人員可以得到相同亞型不同源或不同年份的流感病毒HA的主要的糖基化位點(diǎn)變化，可通過(guò)改變糖基化位點(diǎn)提高其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的中和能力［82］，還可以擴(kuò)大交叉保護(hù)作用［83］。

4 流感病毒通用疫苗開(kāi)發(fā)存在的挑戰(zhàn)

目前，甲型流感病毒大流行前預(yù)保護(hù)疫苗的研發(fā)仍存在如目標(biāo)流感毒株是否正確、預(yù)測(cè)及免疫接種程序仍需優(yōu)化等諸多挑戰(zhàn)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，先前存在的免疫對(duì)流感病毒感染和疫苗接種的抗體反應(yīng)有很大影響，預(yù)先存在的免疫也會(huì)降低LAIV的復(fù)制［84］，對(duì)評(píng)估新型疫苗在人群中是否提供廣泛的且持久性保護(hù)作用有干擾。同時(shí)，改變免疫途徑和優(yōu)化免疫程序也對(duì)制備出具有誘導(dǎo)廣泛保護(hù)性免疫的通用流感疫苗有重大意義［85，86］。

5 小結(jié)及展望

動(dòng)物模型與人體臨床模型都證明基于血凝素HA的流感通用疫苗具有良好的免疫原性和交叉保護(hù)性，是通用流感病毒候選疫苗側(cè)重的表位之一。對(duì)基于HA的通用流感疫苗的生產(chǎn)及改進(jìn)和廣泛性中和抗體的開(kāi)發(fā)及制備有助于預(yù)防流感病毒感染并有機(jī)會(huì)在將來(lái)省去流感疫苗的季節(jié)性修訂。但是開(kāi)發(fā)具有廣泛保護(hù)作用的流感通用疫苗尚未實(shí)現(xiàn)，仍需要人們密切監(jiān)測(cè)流感毒株，分析生物學(xué)特性，改進(jìn)疫苗接種方法，最終制備高效、安全的通用流感疫苗。