董雨卓 趙馨怡 孟盼 袁其方 于治鑫 張志國

摘 要：采用保加利亞乳桿菌發(fā)酵傳統(tǒng)中草藥燈心草，以燈心草發(fā)酵液為研究對象，采用超聲波法對發(fā)酵品中總黃酮和多糖進行提取。在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行正交試驗，以獲得燈心草發(fā)酵液中總黃酮和多糖的最佳提取工藝條件，結(jié)果表明：在乙醇濃度為50%、料液比為1∶25、超聲提取時間為40min、超聲提取功率為500W的工藝條件下，燈心草發(fā)酵液中總黃酮的最佳得率為4.65%，多糖的最佳得率為7.41%，提取工藝最為理想。

關(guān)鍵詞：燈心草;發(fā)酵液;總黃酮;多糖;提取工藝

中圖分類號 R282.71文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）07-0015-04

Optimization of the Extraction Technology of Total Flavone and Polysaccharide from Juncus Effusus Fermentation liquor

DONG Yuzhuo et al.

（Bioengineering College of Daqing normal University， Daqing 163712， China）

Abstract： Traditional Chinese herbal medicine Juncus Effusus was fermented by Lactobacillus bulgaricus， The Extraction Technology of Total flavone And Polysaccharide from Juncus Effusus Fermentation liquor. On the basis of single test， orthogonal experimental design was studied through the central composite design.The optimum extraction technology was determined as follows：Ethanol concentration 50%， 1iquid-to-solid-ratio 1：25mL， ultrasonic time 40min and ultrasonic power 500W.Under such conditions， the predicted and experimental values of total flavone and polysaccharide from Juncus effusus fermentation liquor were 4.65% and 7.41%， respectively.

Key words： Juncus effusus; Fermentation liquor; Total flavone; Polysaccharide; Extraction technology

燈心草中草藥為燈心草科燈心草屬植物燈心草的莖髓或全草，其莖髓中含有揮發(fā)油、黃酮類、酚類等多種成分，作為傳統(tǒng)中草藥在治療疾病方面的研究和應(yīng)用十分廣泛，主治水腫、小便不利、心煩不寐、小兒夜啼等癥[1]。中草藥發(fā)酵在中藥研究開發(fā)和中藥材資源的保護和利用等方面為科研工作者提供了新的思路[2]，其過程是將中藥材進行萃取提純與作為菌種的益生菌菌群進行厭氧發(fā)酵，對提取的中藥有效成分進行生物學(xué)轉(zhuǎn)化。目前，關(guān)于燈心草的研究報道主要以燈心草的化學(xué)成分和藥理作用研究為主，而結(jié)合微生物發(fā)酵的相關(guān)研究則較少。為此，本試驗利用星點設(shè)計-效應(yīng)面法和正交試驗設(shè)計優(yōu)化燈心草乳酸桿菌發(fā)酵品中多糖和黃酮類成分的超聲提取工藝進行研究，以優(yōu)選出操作簡單、得率較高的工藝條件，為燈心草的進一步綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

儀器：電子分析天平、紫外-可見分光光度計、數(shù)控超聲波清洗器、超微粉碎機、離心機、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、鼓風(fēng)干燥箱等。

藥品及材料：燈心草中藥飲片（康美藥業(yè)股份有限公司）;蘆丁標準品（含量≥98%，購自中國藥品生物制品檢定所）;葡萄糖標準品（含量≥98%，購自中國藥品生物制品檢定所）;保加利亞乳桿菌（大慶師范學(xué)院生物工程學(xué)院）;MRS培養(yǎng)基;其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 研究方法

2.1 燈心草樣品采集及處理 燈心草置于50℃鼓風(fēng)干燥箱干燥，超微粉碎機粉碎過100目篩，備用。

2.2 液體發(fā)酵菌種的制備 將保加利亞乳桿菌和無菌純水置于超凈工作臺環(huán)境中中充分溶解，用移液槍準確吸取1mL添加到99mL的MRS培養(yǎng)基中，搖勻密封，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h。保加利亞乳桿菌的數(shù)量采用平板計數(shù)法檢測，標準為達到109個/mL。以10%的接菌量再轉(zhuǎn)接到新滅菌的MRS培養(yǎng)基中，密封，37℃恒溫培養(yǎng)72h，得到發(fā)酵燈心草的液體菌種[3]。

2.3 燈心草發(fā)酵 在無菌環(huán)境中，將粉碎烘干后的燈心草粉末準確稱取10g份放入250mL的三角瓶中，向事先活化好的菌液中加入無菌蒸餾水100mL，加入MRS培養(yǎng)基，搖勻。接入20mL保加利亞乳桿菌液體發(fā)酵菌種，邊加邊攪拌，將接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基于恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵培養(yǎng)7d。

2.4 燈心草發(fā)酵品中總黃酮和多糖的提取 稱取一定量經(jīng)保加利亞乳桿菌發(fā)酵的燈心草發(fā)酵液體，置于容量瓶中，按不同料液比，加入一定濃度的乙醇，在一定溫度和一定時間下超聲提取數(shù)次。冷卻，抽濾，合并濾液，減壓抽濾，得到待測液[4]。

2.5 總黃酮標準曲線繪制和含量測定 以蘆丁為標準品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測定[5]。以蘆丁濃度對吸光值作圖，并做線性回歸方程。分別向試管中準確量取100ug/mL的蘆丁標準溶液0.5、1、1.5、2.0，2.5mL，于10mL容量瓶，再分別加5%的亞硝酸鈉溶液0.3mL，充分混勻，靜置6min后，再分別加入0.3mL質(zhì)量分數(shù)10%硝酸鋁溶液，混勻，靜置6min。再分別加入1mol/L氫氧化鈉溶液4mL，混勻，定容，放置6min后，在500nm處測定吸光度值?？傸S酮的含量測定：采用紫外-可見分光光度法測定總黃酮含量。根據(jù)求出的蘆丁標品濃度（C）和吸光度值（A）標準曲線的回歸方程，分別計算出樣品吸光度對應(yīng)蘆丁的濃度，按照如下公式計算燈心草發(fā)酵品中總黃酮得率：

總黃酮含量（%）=（樣品濃度×樣品定容后的體積/樣品的質(zhì)量）×100

2.6 多糖標準曲線繪制和含量測定 以葡萄糖為標準品，采用苯酚-硫酸法法測定[6]。以葡糖糖濃度對吸光值作圖，并做線性回歸方程。配制100μg/mL的葡萄糖標準溶液。分別向5mL容量瓶中準確量取0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25mL的葡萄糖標準溶液，加入0.5mL的5%苯酚溶液，搖勻，迅速加入2.5mL濃硫酸，搖勻，40℃水浴30min后冰水浴放置5min，以相應(yīng)溶劑為空白，在490nm的波長下測定吸光度值。燈心草發(fā)酵品粗多糖含量計算公式如下：

多糖得率（%）=（樣品濃度×樣品定容后的體積/樣品的質(zhì)量）×100

2.7 單因素試驗 根據(jù)2.4項下試驗方法，分別考察不同提取溶劑、乙醇濃度等因素對總黃酮和多糖得率的影響，優(yōu)選出顯著的影響因素。采用綜合加權(quán)法對數(shù)據(jù)進行處理，總黃酮得率以5%為最優(yōu)，多糖得率以10%為最優(yōu)。試驗中總黃酮和多糖得分各占50%，滿分為100分。綜合得分=總黃酮得率/5%×50+多糖得率/10%×50

2.8 正交試驗 為進一步考察提取工藝，進行正交試驗，采用L9（34）正交設(shè)計表，進行優(yōu)化試驗[7]。

3 結(jié)果與分析

3.1 蘆丁標準曲線 根據(jù)2.5項下的操作，在500nm檢測波長下測定，得到回歸方程為：Y=0.0146X+0.0179，相關(guān)系數(shù)R2=0.991。標準曲線如圖1所示，蘆丁濃度在5～25μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2 葡糖糖標準曲線 根據(jù)2.6項下的操作，在490nm檢測波長下測定，得到回歸方程為：Y=0.0207x+0.0909;R2=0.9986。標準曲線如圖2所示，葡萄糖濃度在5～25μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 單因素試驗結(jié)果

3.3.1 提取溶劑 分別考察乙醇、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、水等對總黃酮和多糖的提取工藝的影響，試驗結(jié)果如表1所示。由表1可知，當(dāng)提取溶劑為乙醇時，得率最高，因此選擇乙醇作為提取溶劑。

3.3.2 乙醇濃度 分別考察30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液等對總黃酮和多糖的提取工藝的影響，試驗結(jié)果如表2所示。由表2可知，乙醇濃度對試驗結(jié)果影響顯著，需要進一步考察。

3.3.3 料液比 分別考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30對總黃酮和多糖的提取工藝的影響，試驗結(jié)果如表3所示。由表3可知，料液比對試驗結(jié)果影響顯著，需要進一步考察。

3.3.4 提取次數(shù) 分別考察400W超聲波提取1、2、3、4次對總黃酮和多糖的提取工藝的影響，試驗結(jié)果如表4所示。綜合考慮，超聲提取次數(shù)為3次。

3.3.5 超聲提取時間 分別考察400W超聲提取10min、20min、30min和40min對總黃酮和多糖的提取工藝的影響，試驗結(jié)果如表5所示。由表5可知，超聲時間對試驗結(jié)果影響顯著，需要進一步考察。

3.3.6 超聲功率考察 分別考察300W、400W、500W、600W等超聲頻率對總黃酮和多糖的提取工藝的影響，試驗結(jié)果如表6所示。由表6可知，超聲頻率對試驗結(jié)果影響顯著，需要進一步考察。

3.4 正交試驗結(jié)果 經(jīng)單因素試驗確定了乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲提取時間（C）、超聲功率（D）等4個因素進行正交試驗設(shè)計，因素水平表如表7所示，正交試驗結(jié)果如表8所示，方差分析見表9。

由表8和表9可知，各因素對總黃酮提取率的影響程度依次為A>B>C>D，其中A因素影響顯著，超聲提取功率影響最不顯著。最佳提取工藝為A2B2C3D2，即50%乙醇提取，料液比為1∶25、超聲提取時間為40min、超聲提取功率為500W。

按照上述確定的最佳條件，做3次平行實驗，總黃酮平均提取率為4.65%，多糖得率為7.41%，綜合得分為83.55，比正交試驗表中的任何組合的得率都高。進一步說明正交試驗所得的最佳條件是提取燈心草發(fā)酵液較為理想的工藝。

4 討論

實驗操作過程中，將燈心草制成發(fā)酵品是關(guān)鍵的一步，一定要在嚴格的無菌環(huán)境下進行，為了提高提取效果，藥材應(yīng)盡量粉碎。

臨床上燈心草水煎后服用具有鎮(zhèn)靜安神、消除水腫等作用，保加利亞乳桿菌作為一種乳酸菌，具有促進腸道益生菌恢復(fù)等多種作用。本研究通過保加利亞乳桿菌對燈心草發(fā)酵，探討發(fā)酵過程對燈心草中總黃酮和多糖的影響，下一步將進行燈心草發(fā)酵前后有效成分的比較研究，探討發(fā)酵的作用機制。

近年來，人們熱衷于天然藥用植物的開發(fā)，其中植物黃酮是研究的熱點之一。黃酮是一大類天然產(chǎn)物，具有消炎、鎮(zhèn)痛、抗過敏，抑菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降尿酸、抗腫瘤等作用[8]。將中草藥進行發(fā)酵，可以提高其有效成分的得率，而微生物發(fā)酵中草藥在臨床應(yīng)用上具有重要的研究意義與價值。

5 結(jié)論

采用保加利亞乳桿菌發(fā)酵傳統(tǒng)中草藥燈心草，以燈心草發(fā)酵液為研究對象，采用超聲波法對發(fā)酵品中總黃酮和多糖進行提取。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行正交試驗，以獲得燈心草發(fā)酵液中總黃酮和多糖的最佳提取工藝條件，結(jié)果表明：在乙醇濃度為50%、料液比為1∶25、超聲提取時間為40min、超聲提取功率為500W的工藝條件下，燈心草發(fā)酵液中總黃酮的最佳得率為4.65%，多糖的最佳得率為7.41%，提取工藝最為理想。

參考文獻

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（責(zé)編：張宏民）