薛莉君，楊沛，胡浪濤，陳敏

1.重慶化工職業(yè)學院（重慶 401120）；2.遵義醫(yī)科大學第五附屬（珠海）醫(yī)院（珠海 519100）

檳榔主要分布在中國海南、中國臺灣、越南、馬來西亞等亞熱帶氣候性地區(qū)，在中國被譽為四大南藥之首[1]。檳榔是一種雌雄同株植物，其雄花蕾中富含生物堿、多酚類物質(zhì)等多種生理活性物質(zhì)和微量元素。在醫(yī)學領(lǐng)域中被證實有利于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗炎降脂、利尿除積、抗衰老的功效，因而對人體代謝和生長發(fā)育都有所裨益，是食療和保健佳品[2-3]。檳榔雄花蕾中的多酚類物質(zhì)主要為沒食子酸、香豆酸、兒茶素、綠原酸、阿魏酸和柚皮素，豐富的多酚類物質(zhì)使得其抗氧化活性較高，清除自由基能力較強。在實際生活中，檳榔雄花蕾除被制作為花茶飲料外，其提取物在化妝品、制藥、食品加工中均有所應(yīng)用[4-5]。試驗對檳榔雄花蕾中的多酚類物質(zhì)進行提取和純化，并探討影響多酚類物質(zhì)抗氧化活性的因素。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

檳榔雄花蕾（臺灣共享農(nóng)業(yè)生技股份有限公司）；乙醇（分析純，重慶寶潤化工產(chǎn)品有限公司）；石油醚（工業(yè)純，山東力昂新材料科技有限公司）；DMF（分析純，廣州市三昌化工有限公司）；D301型大孔樹脂（武漢市君奇慧科技有限公司）；C18固相萃取柱（北京吉瑞森科技有限責任公司）；沒食子酸（工業(yè)純，四川省維克奇生物科技有限公司）。

4MZ-120型粉碎機（鄭州馳邦機械設(shè)備有限公司）；索式提取器（蘭州博輝化玻儀器有限公司）；Scientz-IIDM超聲萃取儀[德卡精密量儀（深圳）有限公司]；JQY-C氣浴振蕩器（上海錦玟儀器設(shè)備有限公司）；722N型紫外-可見分光光度計（杭州微米派科技有限公司）；LC-600A高效液相色譜儀（南京科捷分析儀器有限公司）。

1.2 檳榔雄花蕾的預(yù)處理

將雄花蕾表面洗凈，用濾紙吸干表面多余水分，剪碎裝入保鮮袋中晾曬2 d。取出后加入少量乙醇于粉碎機，粉碎至漿狀置于冰箱中備用。

1.3 多酚的提取[6-7]

將備用樣品置于索式提取器中，利用石油醚快速過濾2次進行脫脂和除去生物堿。將剩余物質(zhì)置于超聲萃取儀中進行多酚提取，按照料液比1∶20（V/V）加入DMF提取劑，超聲提取溫度50 ℃，時間20 min，過濾離心得到上清液。上清液經(jīng)真空濃縮后得到多酚提取液。

取3.0 g大孔樹脂于200 mL具塞錐形瓶中，加入一定濃度的多酚提取液，在60 ℃氣浴振蕩器中振蕩吸附。每隔一定時間段取1 mL溶液測定多酚濃度，繪制靜態(tài)吸附多酚的動力學曲線。

1.4 大孔樹脂靜態(tài)吸附多酚的動力學試驗

參考文獻[8-9]，采用準二級速率方程t/Qt=1/(KQe2)+t/Qe分析大孔樹脂對檳榔多酚的靜態(tài)吸附動力學。式中，t為吸附時間，h；Qt為大孔樹脂在t時刻的多酚吸附量，mg/g；Qe為大孔樹脂靜態(tài)平衡吸附量，mg/g；K為準二級速率方程常數(shù)，g/（mg·h）。

1.5 測定方法

1.5.1 HPLC測定

采用C18固相萃取柱，柱溫25 ℃，流動相為乙腈溶液。進樣量10 μL，流速0.5 mL/min。進樣前需用0.22 μm濾膜過濾。

1.5.2 多酚提取量的測定

采用福林酚法[10-11]測定多酚提取量。以沒食子酸為標準品配制標準液。添加Folin-Ciocalteau顯色劑于不同體積沒食子酸標準液中反應(yīng)，并用Na2CO3溶液定容，離心處理后測定760 nm波長處的吸光度，繪制擬合沒食子酸-吸光度標準曲線，得到線性回歸方程y=0.1058x+0.0198，R2=0.9937。取1 mL檳榔多酚提取液按上述方法顯色后，在760 nm波長處測定吸光度。根據(jù)回歸方程計算多酚提取量。

1.5.3 DPPH·自由基清除率測定

參照文獻[12]，采用吸光度法計算DPPH·清除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC分析

將待測樣品在設(shè)定條件下進行測定，高效液相分析圖譜如圖1所示。液相色譜分析的提取液中主要含有8種多酚類物質(zhì)，這8種物質(zhì)在圖1中標記為a～h，a～h的保留時間分別為7.86，9.18，10.94，13.03，15.13，20.29，21.44和23.93 min。同參考文獻[13]中的標準品液相色譜圖相比對，這8種物質(zhì)的分析結(jié)果依次應(yīng)是綠原酸、阿魏酸、山奈素、沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、柚皮素和香豆酸，與檳榔多酚的主要成分相符。

圖1 提取液的HPLC圖譜

2.2 不同溶劑提取多酚的效果比較

考察不同溶劑的提取效果，多酚提取量測定結(jié)果如表1所示。DMF和氯仿提取效果明顯優(yōu)于乙醚、乙酸乙酯和丙酮。其中，氯仿的提取效果最佳。但由于氯仿不穩(wěn)定，極易揮發(fā)，且沸點相對較低（常壓下61℃），不適合后續(xù)大孔樹脂的加熱振蕩吸附（60 ℃）純化操作，故氯仿不適合作為試驗中的提取溶劑。DMF常壓下沸點為153 ℃，揮發(fā)性較氯仿弱，可與水和大多數(shù)有機溶劑混溶，因此提取溶劑選用DMF最為適宜。

表1 各溶劑的提取效果

2.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附多酚的動力學分析

在pH 5.0、氣浴振蕩器溫度60 ℃、振蕩頻率80次/min的條件下測定大孔樹脂不同時間段內(nèi)的吸附量。以t為變量，對大孔樹脂吸附多酚的t/Qt進行線性擬合，擬合結(jié)果如圖2所示。擬合線性方程y=0.01406x+0.0007，相關(guān)系數(shù)R2=0.9987，相關(guān)度水平較高，說明大孔樹脂對多酚的吸附符合該模型假設(shè)。進一步推算出準二級速率常數(shù)K=0.2463 g/（mg·h），大孔樹脂飽和吸附多酚量為68.37 mg/g，與表2中實際測定的飽和吸附量71.03 mg/g較為接近。

圖2 靜態(tài)吸附動力學方程的擬合曲線

表2 不同時間段下大孔樹脂吸附多酚量的測定結(jié)果

2.4 多酚抗氧化活性的分析

2.4.1 料液比對多酚DPPH·清除率和還原能力的影響

表3為不同料液比條件下多酚抗氧化能力的比較。料液比1∶5（V/V）時清除DPPH·能力和還原性能力較弱，料液比1∶20（V/V）時最強。隨著料液比增大，DPPH·清除率和吸光度均呈現(xiàn)先快速增大后緩慢下降趨勢。適合的料液比在能夠增大多酚提取量的同時，既不影響其表觀活性，又不會降低其在溶液體系中的相對濃度。故試驗確定料液比1∶20（V/V）時提取效果最佳。

表3 不同料液比條件下DPPH·清除率和吸光度的測定結(jié)果

2.4.2 提取溫度對多酚DPPH·清除率和還原能力的影響

由圖3可知，提取溫度在40～50 ℃范圍內(nèi)，DPPH·清除率和吸光度呈上升趨勢，上升速率較為緩慢，在50～65 ℃范圍內(nèi)，DPPH·清除率和吸光度呈下降趨勢，且下降速率較大。這是因為在40～50 ℃范圍內(nèi)，多酚類物質(zhì)的溶出能力逐漸增強，多酚提取量緩慢增大，清除DPPH·自由基能力和還原能力緩慢提升。提取溫度50～65 ℃時，多酚的活性開始受到抑制，甚至部分低沸點多酚類物質(zhì)發(fā)生分解，此時雖然溫度的提升有助于多酚溶出量的增大，但卻極為不利于多酚活性的表現(xiàn)，從圖4中可觀察到DPPH·清除率和吸光度的下降速率較大。故試驗確定提取溫度為50 ℃。

圖3 提取溫度對多酚活性的影響曲線

2.4.3 超聲提取時間對多酚DPPH·清除率和還原能力的影響

由圖4可知，DPPH·清除率和吸光度均隨時間延長呈現(xiàn)先增大后趨于平緩趨勢。提取時間在10～20 min內(nèi)，多酚提取量隨時間延長而增大，DPPH·清除率和吸光度會顯著提高，提取時間超過20 min后，雄花蕾中的多酚基本被全部提取出并進入溶液體系，繼續(xù)延長超聲提取時間只會增大如小分子多肽、糖類、微量元素等的滲出，多酚的提取量會有所下降。同時，后續(xù)大孔樹脂吸附的雜質(zhì)也會增多，從而影響多酚的純度。故試驗選定超聲提取時間為20 min。

圖4 提取時間對多酚活性的影響曲線

3 結(jié)論

采用超聲萃取-大孔樹脂純化工藝對檳榔雄花蕾中的多酚類物質(zhì)進行提取和純化，經(jīng)HPLC分析，多酚類物質(zhì)的主要組成成分為綠原酸、阿魏酸、山奈素、沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、柚皮素和香豆酸，與檳榔多酚的主要成分相符。對不同溶劑提取多酚的適用性進行比較，確定選用DMF作為提取溶劑。試驗還對大孔樹脂靜態(tài)吸附多酚的動力學進行分析，確定準二級速率方程符合該動力學特性，擬合出線性方程y=0.01406x+0.0007，相關(guān)系數(shù)R2=0.9987，速率常數(shù)K=0.2463 g/（mg·h），推算出的大孔樹脂飽和吸附量為68.37 mg/g，與實際測定值71.03 mg/g較為接近，說明動力學分析較為契合試驗結(jié)果。試驗從料液比、提取溫度、提取時間3個因素探討對多酚抗氧化活性在DPPH·清除率和還原能力上的影響效果，經(jīng)分析，確定料液比1∶20（V/V）、提取溫度50 ℃、提取時間20 min時，多酚抗氧化活性表現(xiàn)最佳。