丁 樂(lè), 尚飛揚(yáng), 姚傳勇, 戴衛(wèi)國(guó), 何黎琴

(安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230038)

血栓性疾病的發(fā)病率與死亡率較高，嚴(yán)重危害人類健康。臨床應(yīng)用表明，抗血小板藥物能夠抑制血小板的黏附、聚集和釋放，有助于減少心腦血管不良事件的發(fā)生，降低血栓疾病的發(fā)病率和死亡率[1]。目前臨床使用的抗血小板藥物較多，但存在抗血小板聚集療效不佳、藥物抵抗或增加出血風(fēng)險(xiǎn)等缺點(diǎn)[2-4]。因此，尋找高效低毒的新型抗血小板藥物是藥學(xué)工作者關(guān)注重點(diǎn)問(wèn)題之一。

導(dǎo)致血栓形成的因素有很多，其中血小板聚集對(duì)血栓的形成起著關(guān)鍵的作用。人類血小板表面上存在脂蛋白特異性位點(diǎn)，與LDL-C、 ox-LDL結(jié)合后可激活血小板，增強(qiáng)腺苷二磷酸酶和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集作用[5]。此外，高濃度的LDL-C、 ox-LDL可以直接引起血小板聚集。因此，利用拼合原理，選用具有抗血小板聚集活性和降低LDL-C的活性成分進(jìn)行偶聯(lián)，以期得到更好的抗血小板藥物，不失為一種具有良好發(fā)展前景的藥物設(shè)計(jì)思路。

大黃是常用中藥之一，《神農(nóng)本草經(jīng)》上記載：“大黃主下淤血，血閉，寒熱，破癥瘕積聚，留飲，宿食，蕩滌腸胃，推陳致新，通利水殺，調(diào)中化食，安和五臟，生山谷”。由此可知，活血化瘀作用是大黃的重要功效之一。大黃酸是中藥大黃的主要有效成分之一，譚鵬等[6]的研究表明，大黃酸對(duì)血小板表面的P2Y12受體有較高的親和力，與其結(jié)合可有效阻斷ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，從而抑制血栓形成。但由于大黃酸溶解性較差，生物利用度較低，使大黃酸的臨床使用受到了很大限制。現(xiàn)已有多個(gè)課題組對(duì)大黃酸進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，得到的系列大黃酸衍生物在藥理活性、溶解性能和生物利用度方面均具有較大的改善[7-10]，這為大黃酸的進(jìn)一步的修飾改造打下良好的基礎(chǔ)。

煙酸為臨床上常用的調(diào)節(jié)血脂異常的藥物，在藥理劑量下能降低總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)、三酰甘油(TG)的量，同時(shí)還能夠有效地升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平[11-13]。煙酸除了具有良好的降血脂作用外，還有擴(kuò)張外周血管，抑制血小板聚集，抑制TXA2合成和促進(jìn)PGI2合成等作用[14]。孿藥是指將兩個(gè)相同或不同的先導(dǎo)化合物或藥物經(jīng)共價(jià)鍵連接，綴合成的新分子，在體內(nèi)代謝生成以上兩種藥物而產(chǎn)生協(xié)同作用，增強(qiáng)活性或產(chǎn)生新的藥理活性，或者提高作用的選擇性。成功用于臨床的孿藥不少，如依托貝特，為氯貝酸(貝特類)與煙酸通過(guò)化學(xué)鍵連接所形成的前體藥物。它不僅具有貝特類藥物所具有的強(qiáng)大的降低總膽固醇(TG)和升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)血中濃度的能力，同時(shí)還具有煙酸類強(qiáng)大的降低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的能力和中等強(qiáng)度地降TC及能輕微地降低血壓，有貝特和煙酸的雙重功效而又減少和彌補(bǔ)了它們各自的缺陷和不足。

受此啟發(fā)，本文將具有P2Y12受體阻滯作用的大黃酸(1)與具有降低LDL-C作用的煙酸通過(guò)不同連接橋偶聯(lián)，設(shè)計(jì)并合成了5個(gè)新型的大黃酸煙酸偶聯(lián)物(3a～3e, Scheme 1)，并對(duì)其體外抗血小板聚集活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，期望得到具有多靶點(diǎn)的高療效、低不良反應(yīng)并產(chǎn)生的協(xié)同作用的抗血小板藥物。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Mel-TEMP Ⅱ型數(shù)字熔點(diǎn)儀；Bruker AV Ⅲ 600 MHz型核磁共振儀；Finnigan LCQ Advantage MAX型液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀。

大黃酸(98%)，西安小草植物科技有限責(zé)任公司；二溴烷烴，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；煙酸,分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 大黃酸-溴代烷基酯(2a～2e)的合成通法[15]

將大黃酸284 mg(1 mmol)，三乙胺0.6 mL(4 mmol)，四正丁基溴化銨322 mg(1 mmol)加入到10 mL四氫呋喃(THF)中，于30 ℃攪拌5 min；加入二溴烷烴4 mmol，反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測(cè))。過(guò)濾，濾液減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：A=V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/5]純化得黃色固體2a～2e，收率81%～85%。

(2)3a～3e的合成通法[12]

將2a～2e(0.5 mmol)溶于10 mL DMF中，依次加入煙酸123 mg(1 mmol)，碳酸鉀276 mg(2 mmol)，催化量碘化鉀，攪拌下于50 ℃反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測(cè))。抽濾，濾液加水150 mL，用乙酸乙酯(3×50 mL)萃取，合并有機(jī)層，依次用飽和食鹽水(50 mL)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，濾液減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A)純化得到深黃色固體3a～3e。

3a: 黃色固體，收率67.3%, m.p.136.3～137.7 ℃;1H NMR(CDCl3, 600 MHz)δ: 12.01(s, 1H, OH), 11.93(s, 1H, OH), 9.26(s, 1H, PyH), 8.79(s, 1H, PyH), 8.42(d,J=8.8 Hz, 1H, PyH), 8.33(d,J=8.9 Hz, 1H, PhH), 7.94(s, 1H, PhH), 7.86(d,J=8.7 Hz, 1H, PhH), 7.75～7.72(m, 1H, PyH), 7.43～7.39(m, 1H, PhH), 7.34(d,J=7.3 Hz, 1H, PhH), 4.72(t,J=6.2 Hz, 4H, CH2); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C23H16NO8{[M+H]+}434.0831, found 434.0913。

3b: 黃色固體，收率66.2%, m.p.123.7～125.6 ℃;1H NMR(CDCl3, 600 MHz)δ: 12.01(s, 1H, OH), 11.94(s, 1H, OH), 9.25(s, 1H, PyH), 8.77(s, 1H, PyH), 8.41(d,J=8.7 Hz, 1H, PyH), 8.32(d,J=8.8 Hz, 1H, PhH), 7.95(s, 1H, PhH), 7.87(d,J=8.4 Hz, 1H, PhH), 7.74～7.72(m, 1H, PyH), 7.42～7.37(m, 1H, PhH), 7.33(d,J=7.1 Hz, 1H, PhH), 4.72～4.69(t,J=6.1 Hz, 4H, CH2), 2.43～2.41(m, 2H, CH2); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C24H18NO8{[M+H]+}448.0988, found 448.1036。

3c: 黃色固體，收率77.9%, m.p.122.1～123.5 ℃;1H NMR(CDCl3, 600 MHz)δ: 12.02(s, 1H, OH), 11.94(s, 1H, OH), 9.23(s, 1H, PyH), 8.78(s, 1H, PyH), 8.38(s, 1H, PyH), 8.29(d,J=8.8 Hz, 1H, PhH), 7.91(s, 1H, PhH), 7.85(d,J=8.5 Hz, 1H, PhH), 7.72～7.67(m, 1H, PyH), 7.41～7.37(m, 1H, PhH), 7.35(d,J=7.0 Hz, 1H, PhH), 4.68(t,J=6.3 Hz, 4H, CH2), 1.77～1.75(m, 4H, CH2); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C25H20NO8{[M+H]+}462.1144, found 462.1229。

3d: 黃色固體，收率72.0%, m.p.118.3～120.1 ℃;1H NMR(CDCl3, 600 MHz)δ: 12.01(s, 1H, OH), 11.93(s, 1H, OH), 9.25(s, 1H, PyH), 8.79(s, 1H, PyH), 8.42(d,J=8.7 Hz, 1H, PyH), 8.32(d,J=8.7 Hz, 1H, PhH), 7.94(s, 1H, PhH), 7.87(d,J=8.8 Hz, 1H, PhH), 7.75～7.72(m, 1H, PyH), 7.43～7.39(m, 1H, PhH), 7.34(d,J=7.1 Hz, 1H, PhH), 4.69(t,J=5.9 Hz, 4H, CH2), 1.76～1.73(m, 4H, CH2), 1.56～1.53(m, 2H, CH2); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C26H22NO8{[M+H]+}476.1301, found 476.1386。

3e: 黃色固體，收率73.8%, m.p.113.7～115.4 ℃;1H NMR(CDCl3, 600 MHz)δ: 12.02(s, 1H, OH), 11.94(s, 1H, OH), 9.22(s, 1H, PyH), 8.77(s, 1H, PyH), 8.41(d,J=8.8 Hz, 1H, PyH), 8.30(d,J=8.8 Hz, 1H, PhH), 7.93(s, 1H, PhH), 7.87(d,J=8.8 Hz, 1H, PhH), 7.75～7.72(m, 1H, PyH), 7.43～7.39(m, 1H, PhH), 7.34(d,J=7.5 Hz, 1H, PhH), 4.37(t,J=6.1 Hz, 4H, CH2), 1.75～1.73(m, 4H, CH2), 1.42～1.39(m, 4H, CH2); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C26H24NO8{[M+H]+}490.1457, found 490.1546。

1.3 體外抗血小板聚集活性實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

參照文獻(xiàn)[16]方法，以阿司匹林(ASP)和煙酸為陽(yáng)性對(duì)照藥，采用比濁法對(duì)目標(biāo)化合物3a～3e進(jìn)行了體外抗血小板聚集活性測(cè)試，結(jié)果如表1所示。

表1 化合物3a～3e的血小板聚集抑制率(AIR)

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

將具有P2Y12受體阻滯作用的大黃酸，與具有降低LDL-C作用的煙酸通過(guò)不同碳數(shù)的烷基連接臂偶聯(lián)，合成了5個(gè)新的大黃酸煙酸偶聯(lián)物。在目標(biāo)化合物合成路線設(shè)計(jì)的過(guò)程中，考慮到研究室前期曾對(duì)大黃酸與二溴烷烴反應(yīng)的條件進(jìn)行優(yōu)化并以良好收率獲得中間體2a～2e，參考此方法，以大黃酸為起始原料，與二溴烷烴反應(yīng)生成相應(yīng)的大黃酸溴代烷基酯，收率達(dá)80%以上；本文還對(duì)目標(biāo)化合物的反應(yīng)條件進(jìn)行了考察與優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其最佳反應(yīng)條件為：DMF為溶劑，物料比n(大黃酸溴代烷基酯)/n(煙酸)=1/2，反應(yīng)溫度為50 ℃，收率66.2%～77.9%。

2.2 藥理活性

體外抗血小板聚集活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表1)，目標(biāo)化合物3a～3e對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集具有較好的抑制作用，血小板聚集抑制率在11.68%～29.28%，除化合物3d(AIR為11.68%)的活性略低于陽(yáng)性對(duì)照藥阿司匹林(AIR為15.27%)，其余化合物的活性均強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照藥阿司匹林，尤其以3a的活性最佳(AIR為29.28%)。

利用拼合原理，以不同碳數(shù)的烷烴鏈為連接臂，將具有活血化瘀作用的大黃酸與降血脂藥煙酸偶聯(lián)，得到相應(yīng)的大黃酸煙酸偶聯(lián)物(3a～3e)。采用比濁法對(duì)合成的大黃酸煙酸偶聯(lián)物進(jìn)行體外抗血小板聚集活性測(cè)試。結(jié)果表明，目標(biāo)化合物均具有一定的體外抗血小板聚集活性，其中，化合物3a、3b、3e的活性明顯優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥阿司匹林，尤其以3a的活性最佳。