林啟福, 黃精彩,2, 陳海峰, 王 紅, 米文靜, 王玉軍*

(1. 北部灣大學(xué) 廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室，廣西 欽州 535011; 2. 廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004)

牡蠣又名生蠔，肉可鮮食，營養(yǎng)豐富，素有“海中牛奶”之稱，同時還可入藥。目前對于牡蠣的藥用成分開發(fā)主要集中在牡蠣蛋白分子或多糖分子中，而對于牡蠣中的一些小分子成分及其藥理活性的研究甚少。2012年，Chiba等[1]從太平洋牡蠣Crassostreagigas中分離得到天然的酚類抗氧化劑3,5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol，并命名為DHMBA。隨后該課題組還進一步研究了該化合物的抗氧化機理以及活性[2]，發(fā)現(xiàn)DHMBA是一種新型、有效的抗氧化劑，能有效保護肝細(xì)胞免受氧化應(yīng)激引起的凋亡和壞死[3]，具有體外肝細(xì)胞保護作用，富含DHMBA的牡蠣提取物在預(yù)防或減輕非酒精性脂肪性肝炎(NASH)方面具有很大的潛力[4]。此外，其團隊還通過體內(nèi)微透析實驗和體外腦切片實驗中大鼠的谷氨酸能神經(jīng)元活性分析發(fā)現(xiàn)DHMBA和Zn2+結(jié)合在靜態(tài)條件下能抑制谷氨酸能神經(jīng)元活性[5]。目前，關(guān)于DHMBA結(jié)構(gòu)修飾的文獻報道并不多，而且尚未有抑菌活性方面的研究，Vergne等[6]將DHMBA分子修飾成具有噻二唑結(jié)構(gòu)的化合物，并發(fā)現(xiàn)其具有顯著抑制磷酸二酯酶(PDE7A1)的活性，抑制效果達到納摩爾級；Daikonya等[7]通過化學(xué)修飾將DHMBA分子轉(zhuǎn)化為黃酮化合物，并通過生物活性研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(RAW264.7)產(chǎn)生和釋放一氧化氮的作用。

縮氨基硫脲衍生物具有較高的抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗瘧疾、抗結(jié)核等生物活性，在醫(yī)藥和臨床領(lǐng)域備受關(guān)注[8-12]。其中，=NNHC(S)NH-結(jié)構(gòu)為縮氨基硫脲化合物的基本活性單元，氮上的不同結(jié)構(gòu)會影響其抗菌和抗腫瘤等生物活性[13-14]。許多芳香醛酮和雜環(huán)醛酮縮氨基硫脲均具有很好的抗菌活性，并且還可以通過在芳雜環(huán)醛酮的環(huán)上引入不同的取代基使其抗菌活性得到改善[15-16]。因此，取代苯甲醛縮氨基硫脲類化合物己引起廣大藥學(xué)和化學(xué)工作者的研究興趣。

為尋找高效低毒的抗菌藥物，本研究以沒食子酸甲酯為原料，通過甲基化、LiAlH4還原反應(yīng)，得到活性小分子DHMBA，而后通過PCC氧化、縮合反應(yīng)，得到其縮氨基硫脲衍生物；為進一步進行構(gòu)效分析，分別選用與DHMBA結(jié)構(gòu)相近的丁香醛和2,3,4-三羥基苯甲醛作為原料，通過縮合反應(yīng)得到一系列的取代苯甲醛縮氨基硫脲衍生物(Scheme 1)。同時，選用大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)對合成物進行抑菌活性測試。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

X-4型熔點儀；Bruker AV-600 MHz型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))；Agilent 6210 LC/MSD TOF型高分辨質(zhì)譜儀。

大腸桿菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)由北部灣大學(xué)海洋學(xué)院提供；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 3,5-二羥基-4-甲氧基苯甲酸甲酯(1)的合成

取沒食子酸甲酯1.02 g(5.4 mmol)溶解于10 mL DMF，加入碳酸鉀0.91 g(6.5 mmol)，在85 ℃油浴下攪拌1 h；然后將反應(yīng)用冰水浴冷卻至0 ℃，加入碘甲烷0.82 g(5.6 mmol)，攪拌30 min；升至室溫繼續(xù)攪拌24 h[TLC跟蹤，展開劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/2]。用乙酸乙酯(3×30 mL)萃取，合并有機相，減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/3]純化得白色固體1，收率81%, m.p.148～149 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 9.48(s, 2H, -OH), 6.95(s, 2H, Ar-H), 3.77(s, 3H, OCH3), 3.74(s, 3H, -COOCH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 166.1, 150.8, 139.8, 124.5, 108.6, 59.7, 51.9。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道數(shù)據(jù)一致。

(2) 3,5-二羥基-4-甲氧基苯甲醇(2)的合成

將氫化鋁鋰1.82 g(48.0 mmol)溶解于50 mL的四氫呋喃中，置于冰水浴中，保持溫度為0 ℃。另取化合物12.38 g(12.0 mmol)溶解于10 mL的四氫呋喃中，慢慢滴加到上述的氫化鋁鋰溶液中，滴加完畢后室溫攪拌0.5 h；再置于油浴中，保持55 ℃攪拌反應(yīng)2 h[TLC跟蹤，展開劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/1]。加入乙酸乙酯和飽和食鹽水溶液，過濾除去沉淀，濾液用乙酸乙酯(3×30 mL)萃取，合并有機相，減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/1]純化得白色固體3，收率75%, m.p.170～172 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.92(s, 2H, -OH), 6.27～6.28(m, 2H, Ar-H), 4.50(m, 1H, -OH), 4.28(d, 2H,J=5.4Hz, -CH2-), 3.66(s, 3H, -OCH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ:150.6, 138.1, 134.3, 105.7, 63.1, 59.9; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C8H11O4{[M+H]+}171.0657, found 171.0656。以上數(shù)據(jù)與文獻[1]報道數(shù)據(jù)一致。

(3) 3,5-二羥基-4-甲氧基苯甲醛(3)的合成

通過具有較高實效性高的土壤采集方法對土樣進行采集操作，結(jié)合不同類型作物和土壤的研究結(jié)果證實，不同區(qū)域土壤的實際肥力也存在一定差異，同時，為了滿足大豆種植所需要的肥力水平，需要對化肥的調(diào)配比例、使用時間和品種也進行針對性的選擇。依據(jù)農(nóng)家肥料的具體情況，選擇實際使用的化肥量，一般每公頃大豆種植區(qū)域可通過分層法施加15t左右的農(nóng)家肥，其中，首先的施肥深度為5～10cm，再次施肥深度為10～15cm，經(jīng)適當(dāng)?shù)氖┓史绞?，能夠最大限度提高化肥的使用效果，保證肥力提升3～5%左右。

取氯鉻酸吡啶鹽酸鹽PCC 0.86 g(4.0 mmol)溶解于10 mL的四氫呋喃中，置于冰水浴中，保持溫度為0 ℃。另取化合物20.34 g(2.0 mmol)溶解于5 mL四氫呋喃中，慢慢滴加到上述氯鉻酸吡啶鹽酸鹽溶液中，攪拌下反應(yīng)24 h[TLC跟蹤，展開劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/2]。過濾，減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析分離[展開劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/3]純化得白色固體3，收率45%, m.p.149～151 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 9.71(s, 1H, -CHO), 9.62(s, 2H, -OH), 6.86(s, 2H, Ar-H), 3.77(s, 3H, -OCH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 192.1, 151.3, 141.1, 131.8, 108.7, 59.8; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C8H9O4{[M+H]+}169.0501, found 169.0499。

(4) 化合物(4a、5a、6a)的合成(以4a為例)

將化合物384 mg(0.5 mmol)溶解于5 mL的乙醇中，置于75 ℃的油浴中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為3～5，加入鹽酸羥胺42 mg(0.6 mmol)，繼續(xù)反應(yīng)2 h[TLC跟蹤，展開劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/1]。反應(yīng)結(jié)束后，減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/1]純化得白色固體4a。分別以丁香醛和2,3,4-三羥基苯甲醛作為原料，用類似方法合成化合物5a和6a。

3,5-二羥基-4-甲氧基苯甲醛肟(4a)： 白色固體，收率86%, m.p.171～172 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 10.96(s, 1H, N-OH), 9.20(s, 2H, -OH), 7.87(s, 1H, -CH=N), 6.55(s, 2H, Ar-H), 3.68(s, 3H,-OCH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 150.9, 148.0, 136.6, 128.3, 105.7, 59.7; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C8H10NO4{[M+H]+}184.0610, found 184.0611。

3,5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛肟(5a)： 白色固體，收率84%, m.p.121～122 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.05(s, 1H, -CH=N), 6.84(s, 2H, Ar-H), 3.91(s, 6H, -OCH3);13C NMR(150 MHz, CDCl3)δ: 150.6, 147.4, 136.8, 123.4, 104.1, 56.5; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C9H12NO4{[M+H]+}198.0766, found 198.0760。

2,3,4-三羥基苯甲醛肟(6a)： 淡黃色固體，收率76%, m.p.173～174 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.01(s, 1H, -OH), 9.85(s, 1H, -OH), 9.33(s, 1H, -OH), 8.37(s, 1H, N-OH), 8.19(s, 1H, -CH=N), 6.72(d, 1H,J=8.4 Hz, Ar-H), 6.35(d, 1H,J=8.4 Hz, Ar-H);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 149.9, 147.8, 146.1, 132.7, 119.6, 110.3, 107.6; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C7H8NO4{[M+H]+}170.0453, found 170.0450。

(5) 化合物(4b～4d、5b～5d、6b～6d)的合成(以4b為例)

將化合物3168 mg(1 mmol)溶解于10 mL的乙醇中，置于75 ℃的油浴中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為3～5，加入氨基硫脲110 mg(1.2 mmol)，繼續(xù)反應(yīng)2 h[TLC跟蹤，展開劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/1]。減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/1]純化得淡黃色固體4b。用類似方法合成化合物4c～4d、5b～5d和6b～6d。

3,5-二羥基-4-甲氧基苯甲醛縮氨基硫脲(4b)： 淡黃色固體，收率75%, m.p.170～171 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ:11.26(s, 1H, -NH), 9.19(s, 2H, -OH), 8.11(brs, 1H, -NH), 7.83(s, 1H, -CH=N), 7.71(brs, 1H, -NH), 6.70(s, 2H, Ar-H), 3.70(s, 3H, -OCH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 177.7, 150.9, 142.9, 137.4, 129.3, 106.6, 59.9; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C9H12N3O3S{[M+H]+}242.0599, found 242.0601。

3,5-二羥基-4-甲氧基苯甲醛縮(N-甲基氨基硫脲)(4c)： 淡黃色固體，收率77%, m.p.169～170 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.28(s, 1H, -NH), 9.19(s, 2H, -OH), 8.33(q, 1H,J=4.2 Hz, -NH), 7.83(s, 1H, -CH=N), 6.72(s, 2H, Ar-H), 3.71(s, 3H,-OCH3), 3.00(d, 3H,J=4.8 Hz, N-CH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 177.5, 150.8, 142.3, 137.3, 129.5, 106.6, 59.8, 30.8; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C10H14N3O3S{[M+H]+}256.0756, found 256.0756。

3,5-二羥基-4-甲氧基苯甲醛縮(N-苯基氨基硫脲)(4d)： 淡黃色固體，收率76%, m.p.153～154 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.65(s, 1H, -NH), 9.96(s, 1H, -NH), 9.21(s, 2H, -OH), 7.94(s, 1H, -CH=N), 7.58(d, 2H,J=7.2 Hz, Ar-H), 7.36(t, 2H,J=7.8 Hz, Ar-H), 7.19(t, 1H,J=7.2 Hz, Ar-H), 6.82(s, 2H, Ar-H), 3.71(s, 3H, OCH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 175.6, 150.9, 143.4, 139.1, 137.5, 129.2, 128.1, 125.4, 125.2, 106.9, 59.9; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C15H16N3O3S{[M+H]+}318.0912, found 318.0914。

3,5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛縮氨基硫脲(5b)： 淡黃色固體，收率82%, m.p.113～114 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.31(s, 1H, -NH), 8.79(s, 1H, -OH), 8.13(brs, 1H, -NH), 8.00(brs, 1H, -NH), 7.92(s, 1H, -CH=N), 7.04(s, 2H, Ar-H), 3.80(s, 6H,-OCH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 177.4, 148.1, 142.9, 137.7, 124.4, 104.9, 56.1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C10H14N3O3S{[M+H]+}256.0756, found 256.0753。

3,5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛縮(N-甲基氨基硫脲)(5c)： 淡黃色固體，收率86%, m.p.233～234 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.38(s, 1H, -NH), 8.82(s, 1H, -OH), 8.38(q, 1H,J=4.2 Hz, -NH), 7.93(s, 1H, -CH=N), 7.04(s, 2H, Ar-H), 3.82(s, 6H,-OCH3), 3.04(d, 3H,J=4.8 Hz, N-CH3);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 177.4, 148.1, 142.6, 137.8, 124.4, 105.0, 56.2, 30.8; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C11H16N3O3S{[M+H]+}270.0912, found 270.0912。

3,5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛縮(N-苯基氨基硫脲)(5d)： 淡黃色固體，收率87%, m.p.178～179 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.74(s, 1H, -NH), 9.99(s, 1H, -NH), 8.88(s, 1H, -OH), 8.05(s, 1H, -CH=N), 7.57(d, 2H,J=7.8 Hz, Ar-H), 7.36～7.39(m, 2H, Ar-H), 7.20～7.23(m, 1H, Ar-H), 7.13(s, 2H, Ar-H), 3.83(s, 6H, OCH3);13C NMR(150MHz, DMSO-d6)δ: 175.6, 148.1, 143.7, 139.2, 138.1, 128.1, 126.2, 125.4, 124.1, 105.4, 56.2; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H18N3O3S{[M+H]+}332.1069, found: 332.1060。

2,3,4-三羥基苯甲醛縮氨基硫脲(6b)：黃色固體，收率72%, m.p.252～253 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.20(s, 1H, -OH), 9.51(s, 1H, -NH), 8.97(s, 1H, -NH), 8.43(s, 1H, -NH), 8.24(s, 1H, -OH), 7.95(s, 1H, -OH), 7.75(s, 1H, -CH=N), 7.12(d, 1H,J=8.4 Hz, Ar-H), 6.33(d, 1H,J=8.4 Hz, Ar-H);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 177.0, 148.3, 146.6, 142.1, 132.7, 118.2, 112.6, 107.8; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C8H10N3O3S{[M+H]+}228.0443, found 228.0444。

2,3,4-三羥基苯甲醛縮(N-甲基氨基硫脲)(6c)： 黃色固體，收率73%, m.p.221～222 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.22(s, 1H, -OH), 9.50(s, 1H, -OH), 8.98(brs, 1H, -NH), 8.43(s, 1H, -OH), 8.26(q, 1H,J=4.8 Hz, -NH), 8.23(s, 1H, -CH=N), 7.15(d, 1H,J=8.4 Hz, Ar-H), 6.34(d, 1H,J=8.4 Hz, Ar-H), 2.98(d, 3H,J=4.8 Hz, N-CH3) ;13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 177.1, 148.1, 146.5, 141.4, 132.7, 118.0, 112.7, 107.6, 30.8; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C9H12N3O3S{[M+H]+}242.0599, found 242.0592。

2,3,4-三羥基苯甲醛縮(N-苯基氨基硫脲)(6d)：黃色固體，收率70%, m.p.185～186 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.60(s, 1H, -OH), 9.93(s, 1H, -OH), 9.56(s, 1H, -OH), 9.04(brs, 1H, -NH), 8.49(brs, 1H, -NH), 8.37(s, 1H, -CH=N), 7.58(d, 2H,J=7.8 Hz, Ar-H), 7.33～7.36(m, 2H, Ar-H), 7.30(s, 1H, Ar-H), 7.16～7.18(m, 1H, Ar-H), 6.37(d, 1H,J=9.0 Hz, Ar-H);13C NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ: 175.1, 148.5, 146.8, 142.3, 139.3, 132.8, 128.0, 125.3, 125.0, 118.4, 112.5, 107.8; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C14H14N3O3S{[M+H]+}304.0756, found 304.0756。

1.3 抑菌活性測試

采用濾紙片法測定化合物的抑菌活性。以DMSO為溶劑，將樣品配制成10， 20和40 mg·mL-1的溶液；配制培養(yǎng)基，并滅菌、接種、細(xì)菌培養(yǎng)；采用涂布法將細(xì)菌在培養(yǎng)皿上涂布均勻，將直徑為6 mm的濾紙片分別用不同濃度的合成物樣液浸泡后，標(biāo)記放于培養(yǎng)皿中，于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，測量抑菌圈直徑，重復(fù)3次取平均值；以硫酸慶大霉素為陽性對照，DMSO為空白對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

以沒食子酸甲酯為原料，通過甲基化和氫化鋁鋰還原兩步反應(yīng)制得活性小分子DHMBA，總收率達到61%；而用PCC氧化DHMBA制備3,5-二羥基-4-甲氧基苯甲醛(3)的收率不高(僅45%)，可能是由于DHMBA苯環(huán)上的羥基也易受氧化，生成副產(chǎn)物導(dǎo)致收率不高。通過縮合反應(yīng)制備肟類衍生物和縮氨基硫脲類衍生物的過程中，增加羥胺和氨基硫脲類化合物的用量，使其適當(dāng)過量可以提高收率，能以較好的收率(70%～87%)得到相應(yīng)的目標(biāo)產(chǎn)物。

2.2 抑菌活性

表1為化合物2～6的抑菌活性測試結(jié)果。由表1可知，活性小分子DHMBA(2)及其醛類衍生物3的抑菌效果不顯著，僅當(dāng)其濃度達到40 mg·mL-1時，才對大腸桿菌表現(xiàn)出微弱的抑制活性，對金黃色葡萄球菌則未顯示出抑菌活性；通過結(jié)構(gòu)修飾，其含氮衍生物4a～4d的抑菌活性均有所增強，在10～40 mg·mL-1內(nèi)，對受試菌種均表現(xiàn)出一定的抑制活性。初步的構(gòu)效關(guān)系顯示，(1)對比縮氨基硫脲類衍生物的抑菌活性，肟類衍生物4a、5a和6a的抑菌效果較差；(2)縮氨基硫脲類衍生物氮上的取代基對其抑菌活性有一定的影響，不含取代基時抑菌效果最佳；(3)苯環(huán)上羥基的個數(shù)越多，抑菌活性越顯著，含氮衍生物6a～6d的抑菌效果最佳，4a～4d次之，5a～5d的效果最差。

表1 目標(biāo)化合物的抑菌活性*

合成了牡蠣中的活性小分子DHMBA，并對其結(jié)構(gòu)進修飾，合成了DHMBA的含氮衍生物(4a～4d)；分別以丁香醛和2,3,4-三羥基苯甲醛作為原料，合成其含氮衍生物(5a～5d)和(6a～6d)。初步的抑菌活性測試結(jié)果表明,縮氨基硫脲類衍生物4b、6b和6d對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌兩種受試菌株的抑菌效果最好，具有進一步研究的價值。