張晨 左其生 鄒藝琛 趙娟娟 張亞妮 李碧春

（揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室 揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

原始生殖細(xì)胞（primordial germ cell，PGC）的形成需要多種因素的參與，從遺傳的角度來(lái)說(shuō)，基因表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)、表觀遺傳修飾等都對(duì)PGC的形成具有調(diào)控作用。不僅如此，Brinster等［1］提出PGC （小鼠）具有特別的能量代謝方式——偏愛(ài)丙酮酸氧化而不能氧化葡萄糖。因此代謝變化也可能參與PGC的形成。

相比遺傳和表觀遺傳因素的調(diào)控，代謝方式的變化對(duì)表型變化的影響更為直接和明顯。研究發(fā)現(xiàn)能量代謝方式在不同細(xì)胞中并不相同，大多的癌細(xì)胞中［2］能量代謝方式主要以糖酵解途徑為主，氧化磷酸化途徑不參與癌癥發(fā)生過(guò)程；而正常細(xì)胞通常以線粒體氧化磷酸化產(chǎn)能，而不依賴糖酵解途徑［3］。在PGC細(xì)胞中也同樣表現(xiàn)為氧化磷酸化為主的能量代謝模式［4］；在精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cell，SSC）中，為了維持其自我更新能力，細(xì)胞通常利用糖酵解途徑進(jìn)行產(chǎn)能［5］。這種現(xiàn)象提示我們能量代謝模式的改變可能影響細(xì)胞的命運(yùn)決定。重編程過(guò)程印證了這一猜想，體細(xì)胞的氧化磷酸化代謝轉(zhuǎn)變?yōu)閕PS的糖酵解依賴代謝模式是多能性獲得的基礎(chǔ)［6］。因此代謝組的重組可能是引起細(xì)胞分化的原因。然而代謝途徑的變化在PGC形成中的調(diào)控研究尚不明確。

甲萘醌VK3可通過(guò)單電子還原反應(yīng)，產(chǎn)生半醌基團(tuán)；或通過(guò)雙電子還原得到氫醌。通過(guò)醌的氧化還原循環(huán)可產(chǎn)生活性氧簇等，增加氧化還原反應(yīng)［7］。研究表明，VK3可作為丙酮酸激酶PKM2的專一性抑制劑，而不抑制PKL和PKM1，有效抑制糖酵解途徑［8］。然而對(duì)VK3功能的研究主要集中在對(duì)癌癥的抑制效果上［9-10］，在細(xì)胞分化中的調(diào)控作用還未有研究。相反，研究表明［11-12］DASA58可靶向激活PKM2，PKM2是參與糖酵解過(guò)程的糖酵解酶，可催化合成丙酮酸和ATP，因此DASA58被認(rèn)為是糖酵解途徑的激活劑，在癌癥發(fā)生和免疫過(guò)程的研究中較為常見(jiàn)，其在細(xì)胞分化中的功能還不得而知。

為了研究PGC形成機(jī)制，本研究前期建立了BMP4體外誘導(dǎo)模型［13］，BMP4能夠通過(guò)BMP4信號(hào)促進(jìn)體外雞胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESC）向原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞（primordial germ cell，PGCLC）的分化，而B(niǎo)MP4信號(hào)抑制糖酵解途徑關(guān)鍵激活劑 GSK的功能［14］，因此推測(cè)糖酵解可能參與PGC的形成。本研究對(duì)體外誘導(dǎo)過(guò)程中糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)；在添加糖酵解激活劑和抑制劑后，qRT-PCR檢測(cè)了相關(guān)基因的表達(dá)及類胚體/PGC-like的形成，以期為深入研究代謝系統(tǒng)在PGC形成中的調(diào)控機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)和提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞及主要試劑 新鮮受精蛋來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所試驗(yàn)禽場(chǎng)如皋黃雞。ESCs由實(shí)驗(yàn)室分離所得。高糖DMEM、Knockout培養(yǎng)基、胎牛血清、雞血清、丙酮酸鈉購(gòu)自Gibco公司（美國(guó)）；β-巰基乙醇、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、bFGF、hSCF購(gòu)自Sigma（美國(guó)）；mLIF 購(gòu)自millipore（德國(guó)）；BMP4購(gòu)自ProSpec（以色列）、VK3購(gòu)自Macklin（中國(guó)）、DASA58購(gòu)自MCE（美國(guó)）。

青鏈霉素購(gòu)自（北京）索萊寶科技有限公司；TRNzol Universal 總 RNA 提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DDX4購(gòu)自Abcam。

ESC因子培養(yǎng)基：Knockout DMEM+10%胎牛血清+0.1 mmol/L β-巰基乙醇+1 mmol/L丙酮酸鈉+2 mmol/L的L-谷氨酰胺+1%非必需氨基酸+1 000 IU/mL LIF+10 ng/mL bFGF+5 ng/mL SCF+1×青鏈霉素+2%雞血清。

BMP4誘導(dǎo)培養(yǎng)基：高糖DMEM+1×非必需氨基酸+0.1 mmol/L β-巰基乙醇+1×青鏈霉素+1 mmol/L丙酮酸鈉+ 10 ng/mL LIF+40 ng/mL BMP4+50 ng/mL EGF。

1.2 方法

1.2.1 ESC細(xì)胞誘導(dǎo) 收集0 d的種蛋，藥匙法獲得雞胚胚盤，ESC因子培養(yǎng)基吹散成細(xì)胞懸液，經(jīng)400目濾布過(guò)濾后收集細(xì)胞，接種至60 mm培養(yǎng)皿，差速培養(yǎng)12 h，收集上清，接種至24孔板，體外擴(kuò)增、傳代、備用［15-16］。將傳至第2代的ESCs以2×105個(gè)/孔接種于24孔板中，更換培養(yǎng)基為BMP4誘導(dǎo)培養(yǎng)基，接種至24孔板中，培養(yǎng)6 d，每隔2 d添加200 μL培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分組為：BMP4組，BMP4+VK3組，BMP4+DASA58組。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 在細(xì)胞誘導(dǎo)的第6天觀察細(xì)胞形態(tài)，分別記錄20×10和40×10倍鏡下的細(xì)胞形態(tài)變化并進(jìn)行拍照。利用Image J對(duì)20×10倍鏡下的類胚體數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 RNA提取 將收集的細(xì)胞置于1.5 mL無(wú)酶管中，加入1 mL Trizol進(jìn)行裂解，用移液器吹勻細(xì)胞，在室溫靜置5 min。加入200 mL氯仿，蓋緊蓋子后，劇烈振蕩15 s，室溫靜置2 min。冷凍離心機(jī)中4℃ 12 000×g離心15 min。小心打開(kāi)管蓋，緩慢吸取400 μL上清，加入等體積異丙醇，輕輕混勻，在室溫靜置10 min。冷凍離心機(jī)中4℃ 12 000×g離心10 min，棄去上清。加入1 mL 75%的乙醇，輕輕混勻，此時(shí)可見(jiàn)白色RNA沉淀。冷凍離心機(jī)中4℃ 7 500×g離心5 min，棄去上清。晾干RNA，加入20 μL無(wú)酶水溶解。置于60℃促溶10 min，獲 得RNA。

1.2.4 qRT-PCR 分別收集誘導(dǎo)2 d、4 d和6 d的細(xì)胞，Trizol裂解后提取RNA。利用天根反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照天根實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行定量檢測(cè)目的基因的表達(dá)。引物序列參照表1。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.2.5 流式細(xì)胞分析 收集誘導(dǎo)至6 d細(xì)胞，PBS清洗后，加入10%FBS的PBS 37℃封閉2 h，PBS清洗3次后，用一抗進(jìn)行孵育，37℃孵育2 h或4℃過(guò)夜。PBS清洗3次后，用對(duì)應(yīng)的二抗進(jìn)行孵育，37℃孵育2 h。PBS清洗3次后，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)并處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)組間差異用單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。結(jié)果以平均值形式表示。

2 結(jié)果

2.1 雞PGC-like細(xì)胞形成中糖酵解相關(guān)基因低 表達(dá)

在體外雞ESC誘導(dǎo)形成PGC-like的不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)糖酵解過(guò)程相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，qRTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)第6天時(shí)，糖酵解相關(guān)基因Pgk1的表達(dá)顯著降低（P<0.05），Hk1、Pkm2、Ldha、Glut1、Pfkp和Aldoc的表達(dá)極顯著降低（P<0.01）（圖1）。以上結(jié)果說(shuō)明在PGC-like形成過(guò)程中糖酵解過(guò)程被抑制。

圖1 PGC-like形成中糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)Fig. 1 Expression of glycolysis-related genes in the formation of PGC-like

2.2 糖酵解激活劑/抑制劑調(diào)控糖酵解過(guò)程

為研究糖酵解過(guò)程在PGC-like形成中發(fā)揮的作用，本研究將糖酵解抑制劑VK3和糖酵解激活劑DASA58加入PGC-like誘導(dǎo)體系中，分別在不同誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示在誘導(dǎo)第2天時(shí)，添加VK3后，糖酵解相關(guān)基因Hk1、Pkm2、Glut1、Pfkp、Aldoc表達(dá)極顯著降低（P<0.01），而添加DASA58后，Ldha和Pfkp表達(dá)顯著升高（P<0.05），Hk1和Pgk1表達(dá)極顯著升高（P<0.01）。而在誘導(dǎo)第4天時(shí)，添加VK3后，Hk1、Pkm2、Ldha、Glut1、Pfkp、Aldoc和Pgk1表達(dá)極顯著降低（P<0.01）。誘導(dǎo)第6天時(shí)，添加DASA58后，Glut1、Pfkp和Pgk1表達(dá)極顯著升高（P<0.01）（圖2）。以上結(jié)果說(shuō)明糖酵解抑制劑VK3和激活劑DASA58可調(diào)控糖酵解過(guò)程。

圖2 體外誘導(dǎo)過(guò)程中糖酵解抑制劑/激活劑對(duì)糖酵解相關(guān)基因的影響Fig. 2 Effects of glycolysis inhibitors/activators on glycolysis-related genes during the induction in vitro

2.3 糖酵解途徑抑制類胚體形成

本研究在BMP4誘導(dǎo)體系中添加VK3和DASA58，并在第6天觀察其對(duì)類胚體形成的影響。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示BMP4誘導(dǎo)后，出現(xiàn)帶有囊腔形態(tài)的典型類胚體特征細(xì)胞，且細(xì)胞發(fā)生聚團(tuán)生長(zhǎng)的現(xiàn)象；在此基礎(chǔ)上，添加VK3后，帶有囊腔形態(tài)的類胚體數(shù)量增加并大量聚團(tuán)（P<0.01）；而添加DASA58后，無(wú)典型的類胚體樣細(xì)胞形成（圖3）。以上結(jié)果說(shuō)明抑制糖酵解途徑促進(jìn)類胚體的形成。

圖3 體外誘導(dǎo)過(guò)程中糖酵解抑制劑/激活劑對(duì)類胚體形成的影響Fig.3 Effect of glycolysis inhibitor/activator on embryoid body formation during the induction in vitro

2.4 糖酵解途徑抑制PGC-like形成

研究表明PGC-like形成經(jīng)歷類胚體過(guò)程，類胚體中能表達(dá)PGC標(biāo)記基因的細(xì)胞可稱為PGC-like。本研究前期已證明DDX4能夠作為標(biāo)記PGC的特異蛋白進(jìn)行流式分析。因此，在BMP4誘導(dǎo)過(guò)程中添加VK3和DASA58后第6天收集細(xì)胞，流式分析檢測(cè)PGC-like的陽(yáng)性比例，結(jié)果顯示當(dāng)添加VK3后，PGC-like的陽(yáng)性數(shù)量顯著升高（P<0.05），而添加DASA58后，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著降低（P<0.05）（圖4）。以上結(jié)果說(shuō)明糖酵解途徑抑制體外PGC-like 的形成。

圖4 體外誘導(dǎo)過(guò)程中糖酵解抑制劑/激活劑對(duì)PGC-like形成的影響Fig. 4 Effect of glycolysis inhibitor/activator on PGC-like formation during the induction in vitro

3 討論

糖酵解關(guān)鍵酶的表達(dá)影響糖酵解效率參與生物學(xué)過(guò)程，常見(jiàn)的糖酵解關(guān)鍵酶包括HK1/2、5-甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、6-磷酸果糖-1/2-激酶（PFK1/2）、GLUT-1和LDH-A等，這些關(guān)鍵酶的上調(diào)往往造成較高的糖酵解率，在癌癥和重編程過(guò)程中較為常見(jiàn)［17-19］。糖酵解關(guān)鍵酶（如Pglym78/pgam2）功能的喪失對(duì)成肌細(xì)胞融合能力（果蠅和斑馬魚(yú)胚胎）也會(huì)有所影響。本研究發(fā)現(xiàn)與心臟發(fā)育過(guò)程中糖酵解系統(tǒng)的正面調(diào)控作用不同［20］，在體外雞PGC-like形成中糖酵解基因的mRNA表達(dá)普遍下降，可能由于在干細(xì)胞中糖酵解系統(tǒng)具有不同的表達(dá)模式。結(jié)合Zhou等［21］發(fā)現(xiàn)的ES細(xì)胞的能量生產(chǎn)具有二價(jià)特征，會(huì)根據(jù)需要從糖酵解轉(zhuǎn)換為線粒體呼吸。本研究推測(cè)體外ESC向PGC-like誘導(dǎo)分化過(guò)程中，以糖酵解為主要能量代謝途徑的模式逐漸瓦解，細(xì)胞轉(zhuǎn)化為線粒體呼吸。這一推測(cè)還需要進(jìn)一步對(duì)線粒體呼吸相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

研究報(bào)道，甲萘醌VK3通過(guò)激活氧化還原反應(yīng)抑制糖酵解過(guò)程［22-31］。本研究發(fā)現(xiàn)添加VK3后，有效抑制糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)，暗示其可能對(duì)氧化磷酸化過(guò)程起激活作用。而DASA58作為PKM2的激活劑，在本研究中未出現(xiàn)顯著激活PKM2的結(jié)果，可能是檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)過(guò)晚或是40 μmol/L的工作濃度難以滿足激活PKM2的需要。同時(shí)，本研究還觀察到添加DASA58后，Glut1、Pfkp、Pgk1的表達(dá)有所上升，說(shuō)明DASA58的加入確實(shí)影響糖酵解系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，對(duì)糖酵解途徑具有一定的激活作用。

能量代謝確實(shí)影響細(xì)胞的命運(yùn)決定。ESC細(xì)胞往往以糖酵解途徑為主要代謝方式，因此培養(yǎng)液中高濃度的葡萄糖有利于ESC的增殖，而葡萄糖濃度的變化則會(huì)影響ESC的分化［32-34］。研究表明AMP激活的蛋白激酶（AMPK）激活劑AICAR能啟動(dòng)ATP產(chǎn)生的分解代謝途徑，抑制小鼠類胚體的形成［35］。本研究發(fā)現(xiàn)體外雞PGC-like形成中糖酵解相關(guān)基因表達(dá)降低；抑制糖酵解過(guò)程促進(jìn)類胚體形成，激活糖酵解后類胚體形成減少。類胚體是PGClike形成的必經(jīng)階段，糖酵解途徑對(duì)類胚體形成的調(diào)控暗示其對(duì)PGC-like的形成也有相似的調(diào)控模式。本研究通過(guò)流式分析也證明了這一點(diǎn)。這種能量代謝的調(diào)控模式與小鼠體內(nèi)PGC形成過(guò)程氧化磷酸化升高、糖酵解降低的模式不謀而合。說(shuō)明糖酵解過(guò)程不是體內(nèi)外PGC形成所必需的，相反，氧化磷酸化可能在體內(nèi)外PGC形成中起主導(dǎo)作用。然而PGC形成過(guò)程涉及多種調(diào)控因素，其中能量代謝的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)行深入挖掘。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)ESC向PGC-like誘導(dǎo)過(guò)程抑制了糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)。在添加VK3后糖酵解基因表達(dá)降低，促進(jìn)類胚體/PGC-like的形成；而添加DASA58后，Glut1、Pfkp、Pgk1的表達(dá)升高，抑制類胚體/PGC-like的形成。本研究可為后續(xù)研究體內(nèi)外PGC形成中能量代謝調(diào)控模式提供參考和理論。