陳 雪，陳煥文， 梁漢東

（1.煤炭資源與安全開采國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.東華理工大學(xué)，江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330013；3.中國礦業(yè)大學(xué)（北京），地球科學(xué)與測繪工程學(xué)院，北京 100083）

0 引言

鮮橙因其爽口，富含維生素、微量元素等而受到人們的喜愛。人們在消耗大量鮮橙制品的同時(shí)，產(chǎn)生大量的橙皮廢棄物。研究證明柑橘及甜橙果皮中含有豐富的多甲氧基黃酮，具有較好的抗炎活性和抗氧化活性[1-4]；最近研究顯示，川陳皮素（nobiletin，NBT）具有較好抗癌細(xì)胞增殖活性[5]，劉偉等人[6]通過縮合反應(yīng)等手段改變多甲氧基黃酮性質(zhì)，以提高人體利用效率。

目前，測定果皮中黃酮類化合物主要是采用高效液相色譜（HPLC）或與質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS），方健等人[7]用HPLC 測定常山胡柚皮中黃酮類化合物指紋譜圖。Wang Y 等人[8]利用HPLC-MS 測定了35 種柑橘類水果中的39 種黃酮類化合物。但是，這些常用方法樣品處理過程無法了解目標(biāo)黃酮在樣品中的分布。近年來，原位質(zhì)譜分析技術(shù)與方法發(fā)展迅速，其優(yōu)點(diǎn)是無需復(fù)雜樣品前處理，而方便快捷，并可成像[9]。

采用內(nèi)部萃取電噴霧電離（iEESI）[10-12]和表面解吸電噴霧電離（DESI）[13-14]這2 種原位電離方式的質(zhì)譜法直接分析表征橙皮中游離的黃酮類目標(biāo)物，旨在檢驗(yàn)橙皮中黃酮類化合物的種類及分布，并為我國大量橙皮廢棄物[15-18]的高效提取利用提供參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

甲醇（質(zhì)譜級）、甲酸（質(zhì)譜級）、去離子水（質(zhì)譜級），美國Fisher 公司提供；iEESI 離子源[11]，江西省質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室自制。

LTQ 離子阱質(zhì)譜儀，美國賽默飛公司產(chǎn)品；Synapt-G2-Si 高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Q-Tof MS），美國沃特世公司產(chǎn)品，并配有DESI 離子源[12]及HDImage 數(shù)據(jù)處理成像軟件；微量進(jìn)樣針，英國哈密爾頓公司產(chǎn)品。

1.2 樣品及前處理

在當(dāng)?shù)爻匈徺I同品種南非產(chǎn)鮮橙，取皮清潔后晾干，樣品放入1%甲酸水溶液中浸泡4～6 h，取出后放入恒溫冰箱中作iEESI 質(zhì)譜分析（iEESI MS）試驗(yàn)備用，試驗(yàn)時(shí)將橙皮油胞層與白皮層切割為厚1 mm，長3 mm，寬2 mm 的等腰三角形薄片；樣品在1%的甲酸水溶液中浸泡2 h，取出后放入-18 ℃冰箱中作DESI 高分辨質(zhì)譜成像（DESI HRMSI）試驗(yàn)備用，試驗(yàn)時(shí)將橙皮沿橫截面切割為0.5 mm 的薄片。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 iEESI MS 試驗(yàn)條件

試驗(yàn)裝置圖見圖1。

圖1 試驗(yàn)裝置圖

iEESI 源距質(zhì)譜口2 mm，待離子源溫度上升至150 ℃，用鑷子將毛細(xì)管插入處理好的樣品內(nèi)部，毛細(xì)血管內(nèi)部甲醇流速2 μL/min，在正離子模式下進(jìn)行試驗(yàn)，電壓為4 kV（已驗(yàn)證），質(zhì)譜掃描范圍m/z 50～600。具體試驗(yàn)裝置如圖1（a）所示。

1.3.2 DESI MSI 試驗(yàn)條件

將處理好的DESI MSI 樣品用雙面膠固定在載玻片上（雙面膠范圍盡量與樣品大小相同），毛細(xì)管內(nèi)部甲醇流速4 μL/min，待離子源溫度升至150 ℃，正離子模式下電壓4 kV（已驗(yàn)證）進(jìn)行進(jìn)樣，質(zhì)譜掃描范圍質(zhì)荷比為100～1 200。

2 結(jié)果與分析

2.1 iEESI MS

橙皮不同位點(diǎn)一級全掃描質(zhì)譜圖對比見圖2。

圖2 橙皮不同位點(diǎn)一級全掃描質(zhì)譜圖對比

橙皮油胞層和白皮層分別取樣，對樣品進(jìn)行內(nèi)部萃取電噴霧電離，得到質(zhì)量范圍在質(zhì)荷比50～600的全掃譜圖，掃描2 min 后，待信號穩(wěn)定以后，記錄信號強(qiáng)度較高的峰，以純甲醇溶液為空白。一級譜圖扣除空白后，白皮層與油胞層對比圖（見圖2），在通過多級串聯(lián)質(zhì)譜對照譜庫進(jìn)行定性。在油胞層取樣點(diǎn)含有質(zhì)荷比168，343，373，403 等特征峰；白皮層取樣點(diǎn)含有質(zhì)荷比156，167 等的特征峰。通過串聯(lián)質(zhì)譜及相關(guān)文獻(xiàn)，將質(zhì)荷比343，373，403 定性為四甲氧基黃酮（tetramethylfla-vones）、橙皮素（sinnensetin）、川陳皮素（nobe-litin）。

相關(guān)物質(zhì)與分子結(jié)構(gòu)對比見表1。

表1 相關(guān)物質(zhì)與分子結(jié)構(gòu)對比

這3 種物質(zhì)之間分子量依次相差30，代表一個(gè)甲氧基，通過對m/z 403 進(jìn)行多級串聯(lián)質(zhì)譜分析可得其結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)性。

質(zhì)荷比403 的多級串聯(lián)質(zhì)譜圖見圖3。

圖3 m/z 403 多級串聯(lián)質(zhì)譜圖

由圖3 可知，川陳皮素易脫去1 個(gè)甲氧基得到橙皮素，不易脫去2 個(gè)甲氧基形成四甲氧基黃酮，推測質(zhì)荷比343，373，403 不為同源化合物，而是在橙皮中共存的物質(zhì)（MS2 質(zhì)荷比403 cid30eV；MS2 質(zhì)荷比403；MS2 質(zhì)荷比373 cid 20eV）。白皮層中并不存在這3 種物質(zhì)的特征峰，所以可以認(rèn)定這3 種物質(zhì)是特征存在于橙皮油胞層中的多甲氧基黃酮。

川陳皮素、橙皮素、四甲氧基黃酮結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)式見圖4。

圖4 川陳皮素、橙皮素、四甲氧基黃酮結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)式

2.2 DESI MSI

將冷凍后的橙皮沿橫截面切割為厚0.5 mm 的薄片，用雙面膠粘貼在載玻片上制成樣片，然后將制好的切片放入二維移動(dòng)平臺(tái)，對選定區(qū)域進(jìn)行全掃，掃描后依據(jù)質(zhì)荷比信號強(qiáng)弱進(jìn)行成像。橙皮切片平整程度、含水量、厚度對成像效果具有十分重要的影響。因此，切片厚度應(yīng)大于0.5 mm，切割后應(yīng)即刻進(jìn)樣，掃描時(shí)間不宜超過2 h。

成像結(jié)果顯示，質(zhì)荷比343.122 3，373.128 7，403.135 5 橙皮橫截面該物質(zhì)有明顯分布差異，集中分布于橙皮的油胞層，白皮層分布較少，有明顯的分界線且呈點(diǎn)狀分布，由此推斷出這些黃酮類化合物集中分布于橙皮的油胞層，而點(diǎn)狀分布特征表明該物質(zhì)可能存在于油胞層黃色顆粒內(nèi)。iEESI MS 全掃譜圖中得到質(zhì)荷比343，373，403 信號強(qiáng)度最高且僅在外表皮中檢測到，與成像結(jié)果一致，由此可以確定DESI-MS 成像物質(zhì)為四甲氧基黃酮、橙皮素、川陳皮素。綜合以上分析，橙皮中含量較高的3 種黃酮類化合物（四甲氧基黃酮、橙皮素、川陳皮素）在橙皮中均集中于油胞層，而且進(jìn)一步推測得這類物質(zhì)分布于外皮油胞層黃色顆粒內(nèi)。

橙皮素、柚皮素、川陳皮素DESI MSI 成像圖及橙皮橫截切片光學(xué)圖像見圖5。

圖5 橙皮素、柚皮素、川陳皮素DESI MSI 成像圖及橙皮橫截切片光學(xué)圖像

3 結(jié)論

采用內(nèi)部萃取電噴霧電離與表面解析電噴霧電離進(jìn)行橙皮中黃酮類化合物分析，iEESI MS 結(jié)果表明，橙皮油胞層含有十分豐富的川陳皮素等黃酮類化合物，并通過多級串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行黃酮類化合物結(jié)構(gòu)及共存性分析。DESI MSI 結(jié)果顯示，川陳皮素、橙皮素、四甲基黃酮在橙皮橫截面有明顯的分布差異，而且集中分布于橙皮油胞層，在提取橙皮中有益物質(zhì)時(shí)，以橙皮油胞層為原料以獲得更好的提取效果，優(yōu)化提取工藝，節(jié)約提取原料。采用直接質(zhì)譜分析與成像相結(jié)合的方法，明確了橙皮油胞層含有的較多的四甲氧基黃酮、橙皮素及川陳皮素，直觀表征了其不均衡分布現(xiàn)象，旨在為廢棄橙皮利用提供新途徑。