周 政,孟凡萍,趙 丹,牛曉昶,范 慧,李思穎,康菊香,趙 昕

重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 404000

肺癌是我國發(fā)病率、病死率最高的癌癥，每年有超過78萬新發(fā)病例[1]。確診時(shí)間晚、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是肺癌整體生存率較低的兩大主要原因[2]。肺癌已成為我國主要的公共衛(wèi)生問題[3-4]。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在肺癌的診治方面取得了重大進(jìn)展，但肺癌的5年生存率仍低[5]。早期診斷、早期治療以提高肺癌長期生存率仍然任重而道遠(yuǎn)。外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是自發(fā)或因診療操作(手術(shù)、穿刺等)從實(shí)體腫瘤的原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入外周循環(huán)或淋巴系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞，是研究腫瘤轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為的實(shí)時(shí)活檢標(biāo)本。CTCs可在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段檢測到，血液標(biāo)量為7.5 mL時(shí)，其陽性率為30.4%(38/125)～52.9%(18/34)[6-7]。CTCs有3個(gè)亞群，即上皮型、間質(zhì)型、混合型[8]。在腫瘤發(fā)展過程中，循環(huán)系統(tǒng)中的CTCs會(huì)經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，即上皮表達(dá)減少、間質(zhì)表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細(xì)胞黏附力降低，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和浸潤[9-10]。CTCs是導(dǎo)致惡性腫瘤患者腫瘤復(fù)發(fā)及發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要因素，與腫瘤診斷及疾病狀態(tài)緊密相關(guān)。盡管外周血中CTCs的數(shù)量相對(duì)于血細(xì)胞而言，極其稀少(1～10億個(gè)單核血細(xì)胞里可以找到1個(gè)CTCs)[11-12]，但隨著檢測技術(shù)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，CTCs檢測已經(jīng)發(fā)展成一種新興的非侵入性的臨床輔助診斷方法。結(jié)合影像學(xué)或病理學(xué)檢查結(jié)果可更綜合地評(píng)估患者療效及預(yù)后，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及時(shí)有效的管理。本研究探討了晚期肺癌患者外周血CTCs的數(shù)量及分型與患者臨床特征之間的關(guān)系，旨在為CTCs檢測的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 以本院2018年2月至2019年11月診斷的43例初治或復(fù)治的原發(fā)性晚期(Ⅲ期及Ⅳ期)肺癌患者納入研究組。其中男22例，女21例；年齡49～72歲，中位年齡60.8歲。根據(jù)修訂的世界衛(wèi)生組織(WHO)分類法和國際肺癌研究協(xié)會(huì)(IASLC)的第八版TNM分期建議，結(jié)合臨床資料確定入組的晚期肺癌患者[13]。收集患者的一般特征(年齡、性別、吸煙史、是否為初治)和臨床特征(腫塊位置、肺葉分布、臨床分期、病理亞型、器官轉(zhuǎn)移狀況)。在患者進(jìn)行手術(shù)或治療之前，行胸部CT、骨掃描、頭顱MRI、腹部彩超或全身PET/CT影像學(xué)檢查，并采集患者的外周血標(biāo)本。另選擇同期本院健康體檢者31例作為對(duì)照組，其中男19例，女12例；年齡45～71歲，中位年齡59.7歲。兩組研究對(duì)象年齡、性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 儀器：CanPatrol?CTCs(益善生物公司)；Axio Observer A1熒光顯微鏡(德國Zeiss)；恒溫孵育箱(Thermo Fisher 3111)；KDC60低速離心機(jī)(中科中佳公司)；QY-31真空抽濾機(jī)(上海岐耀公司)。主要試劑：人CTCs分型檢測試劑盒[多重信使RNA(mRNA)原位分析法(益善生物)]；紅細(xì)胞裂解液；4%甲醛溶液；磷酸鹽緩沖液(PBS)；洗滌液(0.1×SSC)；前置擴(kuò)增溶液(30%馬血清、1.5%十二烷基硫酸、3 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl、0.5 fmol的前置序列)；擴(kuò)增溶液(30%馬血清、1.5%十二烷基硫酸、3 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl、1.0 fmol的擴(kuò)增序列)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)；蛋白酶。除蛋白酶購自Qiagen公司外，其余試劑購自Sigma公司。

1.3方法

1.3.1采樣 使用真空采血系統(tǒng)(EDTA-K2抗凝管)采集患者5 mL外周血，立即輕柔顛倒混勻8次，防止凝血。不能及時(shí)進(jìn)行制?？捎?～8 ℃保存，預(yù)處理需在標(biāo)本采集后4 h內(nèi)完成。

1.3.2制膜 進(jìn)行CanPatrol?CTCs檢測前，先將紅細(xì)胞裂解，步驟如下：(1)將抗凝血轉(zhuǎn)移至標(biāo)本保存管于室溫靜置30 min；(2)1 850 r/min(600×g)低速離心5 min后棄上清液；(3)加入4 mL PBS和1 mL RI固定劑混勻，靜止8 min后轉(zhuǎn)移至過濾柱；(4)采用真空泵(負(fù)壓0.06 MPa)進(jìn)行抽吸，使細(xì)胞吸附于濾膜；(5)于過濾器中加入1 mL 4%甲醛溶液，固定1 h后棄溶液；(6)依次加入1 mL 50%、70%、100%乙醇溶液，分別室溫靜置2 min后完成細(xì)胞濾膜制備。

1.3.3雜交 取下濾膜進(jìn)行如下操作：親水、透化、消化、探針雜交、預(yù)擴(kuò)增、擴(kuò)增、顯色、復(fù)染。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4鏡檢 于-20 ℃或室溫直接鏡檢：采用全自動(dòng)熒光顯微鏡染色體分析系統(tǒng)軟件，首先進(jìn)行20倍鏡下預(yù)掃，而后于40倍鏡下進(jìn)行細(xì)胞核型拍攝及熒光拍攝，最后進(jìn)行圖片導(dǎo)出。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25～P75)表示，多組間比較行Kruskal-WallisH非參數(shù)檢驗(yàn)，兩組間比較行Man-WhitneyU非參數(shù)檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CTCs表性特征 經(jīng)CanPatrol?CTCs平臺(tái)，將43例晚期肺癌患者的外周血CTCs分離出來，并分為上皮型、間質(zhì)型、混合型3種亞型?；颊咄庵苎狢TCs的表型特征如圖1所示，其中深色熒光(圖1A中全部斑點(diǎn)及圖1B中對(duì)比度稍暗的斑點(diǎn))標(biāo)記的是上皮分子標(biāo)志物(EpCAM及cytokeratin8/18/19)，淺色熒光(圖1C中全部斑點(diǎn)及圖1B中對(duì)比度更亮的斑點(diǎn))標(biāo)記的是間質(zhì)分子標(biāo)志物(Vimentin及Twist)。

注：A為上皮型CTCs；B為混合型CTCs；C為間質(zhì)型CTCs。

2.2CTCs檢出情況 CTCs的檢出范圍為2～49個(gè)，中位數(shù)為13個(gè)；上皮型CTCs的檢出范圍為0～13個(gè)，中位數(shù)為2個(gè)；混合型CTCs的檢出范圍為0～31個(gè)，中位數(shù)為8個(gè)；間質(zhì)型CTCs的檢出范圍為0～33個(gè)，中位數(shù)為2個(gè)。43例患者全都檢出CTCs，陽性率為100.0%；上皮型CTCs、混合型CTCs和間質(zhì)型CTCs的陽性患者分別是33例、42例和34例，陽性率分別為76.7%、97.7%和79.1%。此外，43例晚期肺癌患者中，31例(72.1%，31/43)以混合型CTCs為主?；旌闲虲TCs在數(shù)量和陽性率上相較于上皮型CTCs和間質(zhì)型CTCs更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組均未檢出CTCs，與研究組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3CTCs與患者一般特征的關(guān)系 總CTCs和各亞型CTCs在患者的一般特征(年齡、性別、吸煙史、是否為初治)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示總CTCs數(shù)量及不同表型CTCs的數(shù)量與晚期肺癌患者的年齡、性別、吸煙史以及是否為初治均無關(guān)。見表1。

表1 CTCs與患者一般特征的關(guān)系[M(P25～P75)，個(gè)]

2.4CTCs與患者臨床特征的關(guān)系 總CTCs和各亞型CTCs在患者各臨床特征(腫塊位置、肺葉分布、臨床分期、病理亞型)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 CTCs與患者臨床特征的關(guān)系[M(P25～P75)，個(gè)]

2.5CTCs與患者器官轉(zhuǎn)移的關(guān)系 由于CTCs與腫瘤的轉(zhuǎn)移特性密切相關(guān)，因此將腫瘤的器官轉(zhuǎn)移分為肺內(nèi)轉(zhuǎn)移(同側(cè)肺轉(zhuǎn)移、對(duì)側(cè)肺轉(zhuǎn)移)和肺外轉(zhuǎn)移(臟器轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移)，以進(jìn)一步探討不同器官轉(zhuǎn)移與CTCs數(shù)量及亞型的關(guān)系。在本研究中，共30例晚期肺癌患者發(fā)生了器官轉(zhuǎn)移，占69.8%(30/43)。這30例患者的總CTCs、上皮型CTCs、混合型CTCs和間質(zhì)型CTCs數(shù)量分別為12.50(7.00～20.75)、2.00(1.00～4.00)、7.50(3.00～14.00)、2.00(1.00～5.00)個(gè)。

有肺外轉(zhuǎn)移的患者與無肺外轉(zhuǎn)移的患者：上皮型CTCs的數(shù)量分別為1.00(0.00～2.00)個(gè)和0.00(0.00～0.50)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；混合型CTCs的數(shù)量分別為3.00(2.50～8.50)個(gè)和2.00(2.00～2.50)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);二者總CTCs數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。總CTCs數(shù)量和各亞型CTCs數(shù)量在其他分組中的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但值得注意的是，對(duì)于有臟器轉(zhuǎn)移或骨轉(zhuǎn)移(椎骨更易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，尤其是胸椎)的患者，其總CTCs、上皮型CTCs、混合型CTCs和間質(zhì)型CTCs數(shù)量均多于無臟器轉(zhuǎn)移或骨轉(zhuǎn)移的患者。見表3。

表3 CTCs與患者器官轉(zhuǎn)移的關(guān)系[M(P25～P75)，個(gè)]

續(xù)表3 CTCs與患者器官轉(zhuǎn)移的關(guān)系[M(P25～P75)，個(gè)]

3 討 論

為了有效地分離和檢測CTCs，大量新技術(shù)和新方法被研發(fā)出來，但都未能突破只能單標(biāo)記CTCs或檢測上皮型CTCs的局限，因而實(shí)現(xiàn)對(duì)各表型CTCs的同時(shí)檢測是一個(gè)技術(shù)方面的難題[14]。而CanPatrol?CTCs分型檢測技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)外周血CTCs的快速分離，還實(shí)現(xiàn)了對(duì)各種表型CTCs的同時(shí)檢測。其細(xì)胞采集系統(tǒng)的高效性依賴于納米級(jí)濾膜的使用；此外，該技術(shù)選用特異性mRNA標(biāo)志物(EpCAM、CK、Vimentin、Twist等)作為原位檢測的靶標(biāo)，相較于以往使用蛋白靶標(biāo)的CTCs檢測技術(shù)，該技術(shù)對(duì)CTCs的檢出時(shí)間更早，檢測特異性更高[15]。

本研究中43例晚期肺癌患者均檢出CTCs，其中混合型CTCs陽性率最高，72.1%(31/43)的患者以混合型CTCs為主，表明混合型CTCs的檢出與晚期肺癌具有相關(guān)性，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道結(jié)果一致。但其對(duì)于早、晚期肺癌的鑒別診斷作用還需要進(jìn)一步收集早期肺癌患者進(jìn)行對(duì)比分析。此外，晚期癌癥以混合型CTCs為主的現(xiàn)象也見于結(jié)直腸癌等其他癌癥[17]。

發(fā)生器官轉(zhuǎn)移的患者有30例，其中發(fā)生肺外轉(zhuǎn)移的患者所對(duì)應(yīng)的混合型CTCs與上皮型CTCs，與未發(fā)生肺外轉(zhuǎn)移的患者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，總CTCs數(shù)量也多于未發(fā)生肺外轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)。CTCs脫離原發(fā)病灶后只有極少數(shù)能到達(dá)定植器官形成轉(zhuǎn)移灶，而轉(zhuǎn)移、定植后的CTCs增殖能力依賴于上皮型標(biāo)記物的表達(dá)。在CTCs發(fā)生EMT后細(xì)胞凋亡受到抑制，表型與外周間質(zhì)成分極其相似，免疫系統(tǒng)不易識(shí)別，進(jìn)而可逃避免疫系統(tǒng)的攻擊[18]?；旌闲虲TCs與上皮型CTCs相比，有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，與間質(zhì)型CTCs相比，有更強(qiáng)的增殖能力，因此，混合型CTCs能有效地播散及增殖，形成轉(zhuǎn)移灶[19-20]。

發(fā)生肺外轉(zhuǎn)移的患者共27例，發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的患者數(shù)量最多(16例)，其次是骨轉(zhuǎn)移(13例)和臟器轉(zhuǎn)移(6例)。腦是CTCs肺外轉(zhuǎn)移最常定植的器官，其次是骨骼(尤其是胸椎)。HANSSEN等[21]研究表明，出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者外周血中的總CTCs可作為預(yù)后評(píng)估的參照。也有研究表明，腦可作為轉(zhuǎn)移儲(chǔ)存庫，但骨是CTCs最常寄居的部位，是最常見的儲(chǔ)存庫[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，在骨轉(zhuǎn)移的13例患者中，不同的骨形成轉(zhuǎn)移灶的潛力是不同的，其中椎骨更易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶(尤其是胸椎)。此外，在發(fā)生臟器轉(zhuǎn)移的6例患者中，3例為肝轉(zhuǎn)移，3例為腎轉(zhuǎn)移。對(duì)于轉(zhuǎn)移的偏好和傾向性，還需要進(jìn)一步收集相關(guān)病例進(jìn)行探討。

在43例晚期肺癌患者中，Ⅳ期肺癌患者的總CTCs、混合型CTCs和間質(zhì)型CTCs數(shù)量均多于Ⅲ期患者，且總CTCs數(shù)隨晚期肺癌分期的升高而呈升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。KREBS等[23]研究證明，Ⅳ期NSCLC患者的總CTCs數(shù)明顯多于Ⅲa期和Ⅲb期患者。孫雯雯等[16]研究顯示，在N分期中，N3期的上皮型CTCs數(shù)多于N2期，但N0期的上皮型CTCs數(shù)多于N2期；在M分期中，M1c期的上皮型CTCs數(shù)多于M0期和M1a期。而本研究數(shù)據(jù)顯示，在T分期中，T3期的總CTCs數(shù)多于其他不同分期的間質(zhì)型CTCs；在N分期中，N2期的總CTCs數(shù)多于其他不同分期；在M分期中，M1b期的混合型CTCs數(shù)多于其他所有亞型。

本研究中入組的肺癌包括肺腺癌、肺鱗癌、小細(xì)胞肺癌3種病理亞型，各病理亞型的總CTCs數(shù)和各亞型CTCs的數(shù)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HUANG等[24]薈萃分析結(jié)果表明，CTCs數(shù)量與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與病理分型無關(guān)。CHEN等[25]對(duì)肝細(xì)胞癌CTCs的研究結(jié)果也顯示，發(fā)生EMT的CTCs數(shù)量和亞型與對(duì)應(yīng)的病理分型無關(guān)。

綜上所述，CTCs在晚期肺癌患者的外周血中具有較高的檢出率，尤其是混合型CTCs，可作為晚期肺癌轉(zhuǎn)移評(píng)估的輔助判斷指標(biāo)。CTCs分型檢測對(duì)于探討CTCs轉(zhuǎn)移的器官偏向性也具有重要價(jià)值。CTCs檢測技術(shù)屬于非侵入性檢測手段，可連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測患者術(shù)后CTCs數(shù)量和比例變化，持續(xù)觀察患者的疾病進(jìn)展，推動(dòng)晚期肺癌的精準(zhǔn)診療進(jìn)程。