王 彤，許 斌，徐安明，周 杰，董維亮

(南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800)

乙草胺(2-乙基-6-甲基-N-(乙氧基甲基)-2-氯代乙酰替苯胺)是由美國孟山都公司于1971年開發(fā)的一類氯乙酰苯胺類除草劑，其分子結(jié)構(gòu)主要由苯環(huán)和氯乙酰氨基團組成。乙草胺是一種長鏈脂肪酸抑制劑，通過抑制焦磷酸環(huán)化酶的活性來抑制雜草幼苗的生長，可用于雜草芽前防治，例如一年生禾本科雜草(馬唐、稗草等)和一年生闊葉雜草(野莧等)，對多年生雜草無效[1]。由于除草活性高、應用范圍廣且持效期適中，乙草胺在我國應用面積不斷擴大，自1977年以來的年使用量超過1萬t，是我國生產(chǎn)量和使用量最多的除草劑之一[2]。

乙草胺的化學結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在農(nóng)業(yè)應用過程中只有少量發(fā)揮除草活性，而絕大部分殘留于植物表面或土壤中，隨著雨水遷移到地下水、地表水和河流等生態(tài)環(huán)境中。數(shù)據(jù)調(diào)查顯示，松花江流域沉積物中乙草胺含量可達0.47～11.76 μg/kg，其河岸土壤中含量高達0.03～709.37 μg/kg[3]；淮河流域沉積物中乙草胺含量高達3 900～6 600 μg/kg[4]。進一步研究表明，暴露在環(huán)境中的乙草胺可誘導多種細胞生理毒性進而影響生物體健康，包括對生殖、內(nèi)分泌和心血管系統(tǒng)的毒性效應[4]，并且其與炎癥因子IL-1β直接結(jié)合后可形成免疫毒性[5]。除此之外，最近研究表明乙草胺是一種強致癌物和神經(jīng)毒素，通過評估乙草胺對斑馬魚胚胎細胞的神經(jīng)毒性以及對幼蟲運動行為和基因表達的影響，表明其在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)傳導過程中也具有一定毒性[4, 6]。目前，研究人員在鯉魚、白鰱和虹鱒等水產(chǎn)品中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)乙草胺殘留[7]，這表明乙草胺可以通過生物鏈的富集作用進入生物體內(nèi)，最終有可能威脅人類健康。因此，對環(huán)境中殘留的乙草胺進行有效清除對于保護生態(tài)平衡、保障人類健康都至關(guān)重要。

近年來，利用環(huán)境微生物來清除化學農(nóng)藥殘留因具有效率高、成本低、生態(tài)效益高等優(yōu)點，逐漸成為環(huán)境污染物治理最具有發(fā)展?jié)摿Φ男迯头椒?，也是當前環(huán)境科學領域的研究熱點。本文綜述了國內(nèi)外報道的乙草胺高效降解微生物資源和微生物分解代謝機制的最新研究進展，并對乙草胺等化學農(nóng)藥污染環(huán)境微生物修復技術(shù)的未來研究方向與應用屏障進行討論和展望。

1 乙草胺高效降解微生物資源

豐富的微生物資源是開展乙草胺降解機制研究并實現(xiàn)污染環(huán)境生物修復的基礎。在早期研究中，一些能利用乙草胺作為唯一碳源生長的土著原生菌群是主要的降解性微生物資源。例如，Xu等[8]從乙草胺污染土壤中富集了4種高效降解乙草胺的微生物菌群，其中菌群D可以在9 d內(nèi)降解80 mg/L的乙草胺，降解效率達到了99%。近年來，國內(nèi)外研究人員從污染土壤和活性污泥中篩選及鑒定出大量具備乙草胺降解能力的純培養(yǎng)微生物資源，包括Pseudomonas、Rhodococcus、Bacillus和Sphingomonas等多個菌屬，并在實驗室的模擬環(huán)境中驗證了它們對乙草胺的降解性能(表1)[9-26]。

表1 乙草胺生物降解的微生物資源

然而，真實污染環(huán)境中的乙草胺生物降解面臨更復雜、更苛刻的降解條件，這對降解菌株的環(huán)境耐受性提出了更高要求。王苑力等[24]從乙草胺污染的農(nóng)田土壤中分離出一株耐鹽的乙草胺降解菌Bacillussp.ACD-9，在3 d內(nèi)對初始質(zhì)量濃度為50 mg/L的乙草胺降解率可達56.8%，并能夠在溫度4～50 ℃、pH 4.5～10.0、NaCl質(zhì)量濃度為0～150 g/L的條件下生長。此外，構(gòu)建分工協(xié)作的多細胞體系從而減輕單細胞體系的代謝壓力也是另一種有效的方法。Duc等[25]篩選的菌株P(guān)seudomonasfluorescensKT3能將乙草胺轉(zhuǎn)化為2-甲基-6-乙基苯胺(MEA)，并且MEA進一步被微生物Bacillussubtilis2M6E降解及完全礦化；Hou等[27]以乙草胺為唯一碳源構(gòu)建了含有Rhodococcussp. T3-1、Delftiasp. T3-6和Sphingobiumsp.MEA3-1這3種微生物的多細胞降解體系，在6 d內(nèi)能夠降解100 mg/L的乙草胺，降解效率達到了96%。

2 乙草胺生物降解途徑解析

有機污染物的微生物降解途徑是評價污染物環(huán)境遷移行為、降解菌株生物修復應用潛力的重要參考指標。目前，已報道的乙草胺微生物降解途徑主要有兩種：1)好氧脫烷基途徑；2)厭氧脫氯途徑。

2.1 好氧脫烷基途徑

乙草胺的好氧脫烷基生物降解途徑已經(jīng)相對明確。首先，乙草胺經(jīng)過N-脫烷基反應被轉(zhuǎn)化為2-氯-N-(2-乙基-6-甲基苯)乙酰胺(CMEPA)，CMEPA進一步發(fā)生酰胺水解反應轉(zhuǎn)化為MEA。在此基礎上，MEA能夠通過自發(fā)水解和羥基化反應形成2-甲基-3-羥基-6-乙基對苯二酚(3-OH-MEHQ)，并隨著苯環(huán)的開環(huán)反應進入三羧酸循環(huán)(TCA)，最終被降解為CO2和H2O。Cheng等[28]以雙細胞體系探索了乙草胺的好氧降解途徑，基于農(nóng)藥廠污泥中分離出的菌株Sphingomonassp.DC-6，能夠?qū)⒁也莅忿D(zhuǎn)化為CMEPA和水解產(chǎn)物苯胺衍生物MEA，進一步，MEA在菌株SphingobiumbaderiDE-13的作用下最終實現(xiàn)乙草胺完全礦化。Hou等[27]構(gòu)建了三細胞體系來解析乙草胺的好氧代謝途徑，由于菌株Rhodococcussp. T3-1和Delftiasp. T3-6將乙草胺降解為MEA后不能深入降解，在此基礎上，他們進一步篩選了菌株Sphingobiumsp.MEA3-1，它能夠?qū)⒔到庵虚g體MEA轉(zhuǎn)化為3-OH-MEHQ，最終通過鄰苯二酚開環(huán)途徑完全降解為CO2和H2O(圖1)。

圖1 乙草胺好氧脫烷基微生物降解途徑[27]Fig.1 Aerobic dealkylation pathway of acetochlor[27]

2.2 厭氧脫氯途徑

目前，針對乙草胺厭氧脫氯降解途徑的研究相對較少。與乙草胺好氧脫烷基途徑起始反應不同，厭氧途徑的初始反應為脫氯。首先，乙草胺通過脫除氯乙?；械穆仍幽軌蛐纬?-乙基-6-甲基-N-(乙氧基甲基)-乙酰苯胺(EMEMA)，并進一步通過乙氧基甲基的去除形成N-(2-甲基-6-乙基苯基)乙酰胺(MEPA)。所得中間產(chǎn)物MEPA則可以通過芳香環(huán)甲基的去除及乙?；募谆晦D(zhuǎn)化為N-2-乙基苯基甲酰胺(EPF)，并進一步通過甲?；牧u基化生成2-乙基-N-羧基苯胺(ECA)(圖2)。Liu等[29]通過在活性污泥中外源添加乙草胺進行壓力馴化，獲得了具有乙草胺降解效果的厭氧污泥；其中，Sporomusa、Sporobacterium、Dechloromonas、Azotobacter和Methanobacterium屬的細菌豐度顯著增加，表明這些菌屬可能參與乙草胺的厭氧生物降解過程。然而，乙草胺厭氧脫氯途徑中的關(guān)鍵催化酶目前還未被挖掘和鑒定，這也有待于國內(nèi)外研究人員在后續(xù)的研究中進行完善。

圖2 乙草胺厭氧脫氯微生物降解途徑Fig.2 Anaerobic dechlorination pathway of acetochlor

3 乙草胺降解的生化機制

脫烷基反應是乙草胺好氧微生物降解的起始反應，N-脫烷基酶和C-脫烷基酶能夠催化乙草胺的脫烷基反應。Chen等[30]鑒定了一種來源于SphingomonadsDC-6和DC-2中催化乙草胺N-脫烷基化反應的三組分Rieske非血紅素鐵加氧酶(RHO)體系，由同(源)寡聚體加氧酶、[2Fe-2S]鐵氧化還原蛋白、谷胱甘肽型還原酶3種成分組成。Gao等[31]從菌株Bacillussp. Hys-1中克隆了一個編碼脫羧酶的Debutoxylase基因(Dbo)，該基因編碼的C-脫烷基酶Dbo可催化乙草胺發(fā)生C-脫烷基反應。除此之外，N-乙氧基甲基化酶也能夠催化乙草胺的N-乙氧基甲基化反應生成CMEPA。Wang等[32]采用硫酸銨沉淀法和疏水相互作用色譜法，從菌株Rhodococcussp. T3-1中純化了屬于細胞色素P450體系的N-乙氧基甲基化酶，并證明其為一種可催化乙草胺轉(zhuǎn)化為CMEPA的三組分酶，該團隊進一步在大腸桿菌中成功異源表達了ethBAD基因，驗證其編碼的酶具有N-乙氧基甲基化活性。

酰胺水解反應可使CMEPA水解形成MEA。Li等[17]通過將菌株SphingobiumquisquiliarumDC-2的基因文庫轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，獲得了CMEPA酰胺水解酶基因cmeH，并克隆表達了cmeH基因，由cmeH編碼的酰胺水解酶CmeH能催化CMEPA水解為MEA。Wang等[33]采用硫酸銨沉淀法、二乙氨乙基陰離子交換法、疏水作用色譜法和Sephadex G-200凝膠過濾等蛋白質(zhì)純化方法，從Delftiasp. T3-6中純化出一種高活性的酰胺水解酶DamH，并克隆其編碼基因于大腸桿菌中進行表達，結(jié)果表明：DamH是一種具有酰胺鍵和酯鍵活性的雙功能水解酶，其酰胺水解酶功能的比酶活達到5 036 U/mg，可高效將底物CMEPA水解為MEA，是乙草胺微生物降解過程中第二個關(guān)鍵酶。

MEA將經(jīng)過一系列苯環(huán)羥化過程轉(zhuǎn)化為3-OH-MEAQ，最終通過鄰苯二酚降解途徑完全礦化。Dong等[34]通過比較基因組學的方法挖掘及鑒定了參與MEA降解過程的關(guān)鍵基因meaA和meaB，對應編碼的加氧酶MeaA和還原酶MeaB能夠構(gòu)成新型黃素單加氧酶體系，催化MEHQ羥基化反應，將其轉(zhuǎn)化為3-OH-MEHQ；并且，他們進一步推測，MEA首先通過P450單加氧酶作用轉(zhuǎn)化為4-羥基-2-甲基-6-乙基苯胺(4-OH-MEA)，然后進一步自發(fā)水解脫氨為2-甲基-6-乙基苯胺(MEHQ)。Cheng等[28]通過分析比較MEA降解菌株SphingobiumbaderiDE-13與其MEA降解缺陷突變體的基因組時發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵基因meaXY作為一種雙組分單氧酶系統(tǒng)，能夠利用NADH和黃素單核苷酸作為輔助因子催化MEA的羥基化，將MEA轉(zhuǎn)化為4-OH-MEA。

表2 乙草胺微生物降解過程關(guān)鍵酶

4 乙草胺污染環(huán)境的生物修復

鑒于乙草胺嚴重的環(huán)境毒性和生態(tài)威脅，開發(fā)合理、高效的乙草胺污染環(huán)境修復技術(shù)已經(jīng)刻不容緩。目前，最具應用潛力的乙草胺污染環(huán)境生物修復方式有微生物修復和植物修復2種。

基于乙草胺高效降解微生物資源以及相對清晰的乙草胺微生物降解機制，發(fā)展乙草胺等化學農(nóng)藥污染環(huán)境的微生物修復技術(shù)是研究熱點(圖3)。李強[35]利用盆缽實驗證明菌株Sphingomonassp.或DC-6可有效解除1.0 mg/kg及更高濃度的殘留乙草胺對玉米的藥害，并使乙草胺污染土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)維持平衡。張寧[36]從長期施用乙草胺的花生連作障礙田花生根瘤中，篩選出1株乙草胺高效降解菌Rhizobiumsp. ZL-27，在2.37 mg/kg乙草胺的盆栽土壤中培養(yǎng)40 d后，成功清除了27%的乙草胺。盡管這些已研究的乙草胺污染環(huán)境的微生物修復技術(shù)效率有待提高，但在模擬環(huán)境中的成功修復為乙草胺微生物修復的未來實際應用提供了寶貴的經(jīng)驗和指導。

圖3 微生物修復乙草胺污染環(huán)境Fig.3 Microbial remediation of environmental pollution by acetochlor

利用常見植物對乙草胺等化學農(nóng)藥進行植物修復是另一種有效的生物修復手段。乙草胺的植物修復本質(zhì)是將可實現(xiàn)乙草胺催化降解的關(guān)鍵基因元件導入植物中，構(gòu)建具有乙草胺降解能力的轉(zhuǎn)基因植物，從而實現(xiàn)對于乙草胺污染土壤的植物修復(圖4)。在植物細胞中引入谷胱甘肽合成酶，提高谷胱甘肽的產(chǎn)量，能夠讓所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因植物具備乙草胺等化學農(nóng)藥的同化能力。Gullner等[37]通過在植物中表達γ-谷胱甘肽合成酶，發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)基因植物在乙草胺存在的情況下生產(chǎn)情況顯著強于野生型植物。Chu等[38]將SphingomonaswittichiiDC-6中編碼乙草胺N-脫烷基酶系統(tǒng)的cndA基因?qū)霐M南芥中，并分別在細胞質(zhì)和葉綠體中實現(xiàn)了活性表達，結(jié)果表明：當cndA定位于葉綠體時，擬南芥對乙草胺具有較強的耐受性，并且在48 h內(nèi)可將水中20 μmol/L乙草胺中的94.3%轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)；在30 d內(nèi)可清除含5 mg/kg乙草胺土壤中的80.2%。這一研究結(jié)果對于乙草胺真實污染環(huán)境中植物修復的實際應用具有重要參考價值。

圖4 植物修復乙草胺污染土壤Fig.4 Phytoremediation of acetochlor contamination

5 總結(jié)與展望

綜上所述，隨著我國乙草胺的生產(chǎn)量和使用量不斷增加，具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的乙草胺大量殘留于土壤、水體等生態(tài)環(huán)境中，嚴重影響生態(tài)平衡甚至人類健康。近年來，針對乙草胺不合理使用導致的環(huán)境問題及健康問題，國內(nèi)外研究人員圍繞乙草胺微生物降解技術(shù)開展了大量研究工作。從早期的復雜混菌體系到純菌體系，再到分工合作的人工多細胞體系，研究人員篩選出大量具備乙草胺高效降解及礦化能力的微生物資源，解析了乙草胺的微生物降解路徑并挖掘出與降解相關(guān)的關(guān)鍵酶元件，為真實污染環(huán)境中乙草胺微生物修復技術(shù)的應用打下了堅實的基礎。

目前，許多具有優(yōu)異乙草胺降解能力的菌株已經(jīng)被廣泛報道，然而其降解功能評價大多停留在實驗室模擬體系研究階段。由于真實的污染環(huán)境中存在許多易模擬因素(例如，水分、pH、氧化還原電勢、可溶氧和土著微生物等)，對微生物活性具有重要影響，多數(shù)降解菌株的生物修復效率往往并不理想，甚至無效。因此，對于真實污染環(huán)境的生物修復過程，降解微生物的生存動態(tài)、與土著微生物的相互作用以及真實復雜環(huán)境的影響因素都需要被深入評價。

從自然環(huán)境中篩選出的野生型乙草胺降解菌株普遍存在降解效率低、環(huán)境適應能力差、降解能力不穩(wěn)定等缺點，因此，如何提升真實污染環(huán)境下微生物對于乙草胺的降解及礦化效率是突破乙草胺生物修復應用技術(shù)瓶頸的關(guān)鍵。近年來，隨著合成生物學的不斷發(fā)展，基于代謝路徑改造、定向進化等分子生物學手段對菌株進行改造為乙草胺生物修復效率的提升提供了新的思路。針對高效降解菌株的缺乏，利用液滴微流控、水凝膠制備、熒光探針設計等技術(shù)構(gòu)建乙草胺降解微生物的高通量篩選平臺，能夠大大提升目標微生物的篩選效率；對于已篩選出的乙草胺降解菌株，利用細胞融合及代謝路徑改造等技術(shù)，通過基因克隆、基因突變、基因組編輯等策略，能夠調(diào)控乙草胺降解微生物的代謝路徑，擴大菌株對污染物種類的降解范圍，獲得遺傳穩(wěn)定、環(huán)境適應能力強的乙草胺高效降解模式菌株。

由于真實修復環(huán)境與微生物體內(nèi)環(huán)境間存在巨大差異，所以在實際生物修復應用中的乙草胺降解酶具有催化效率低、穩(wěn)定差等不足。針對關(guān)鍵降解路徑中酶催化效率低這一關(guān)鍵瓶頸，利用定向進化、理性設計、化學修飾等技術(shù)對酶進行改造，能夠?qū)崿F(xiàn)酶催化效率和穩(wěn)定性的顯著增強。酶的定向進化主要包括易錯PCR、DNA改組、隨機引發(fā)重組等技術(shù)。酶的理性設計主要基于酶與底物的相互作用，理性選擇氨基酸殘基為靶點對酶的關(guān)鍵氨基酸進行突變，改變底物結(jié)合能力，實現(xiàn)酶對污染物降解能力的強化?；诨瘜W反應，以功能分子對酶進行化學修飾也是提升酶催化活性及穩(wěn)定性的重要方式。這些酶改造技術(shù)的不斷進步，也為真實污染環(huán)境下乙草胺等環(huán)境污染物生物修復的實際應用提供了更多的選擇。

與此同時，對乙草胺降解途徑解析后發(fā)現(xiàn)，乙草胺完全降解及礦化的實現(xiàn)往往是多種微生物協(xié)同合作、勞動分工的結(jié)果。當微生物菌株以菌群的形式發(fā)揮降解作用時，微生物菌群中不同微生物各有分工，才能夠完成復雜的工作；而且，微生物菌群中微生物往往處于動態(tài)平衡狀態(tài)，對復雜環(huán)境具有更強的適應能力；除此之外，勞動分工有利于減輕純培養(yǎng)微生物的代謝負荷，保證微生物菌群的正常運轉(zhuǎn)。然而，通過簡單的混合微生物菌株構(gòu)建混菌體系并不能實現(xiàn)菌株之間分工合作效率的最大化，因此，如何構(gòu)建高效、可控的人工多細胞體系實現(xiàn)多細胞之間的分工合作優(yōu)化是以后研究的重點。

近年來，隨著新型材料制備技術(shù)的發(fā)展，通過靜電紡絲、3D生物打印等技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)微生物細胞的固定化，也為環(huán)境污染物降解人工多細胞體系的構(gòu)建提供了技術(shù)支持。基于新型功能材料構(gòu)建的細胞固定化能夠?qū)崿F(xiàn)目標微生物的接種比例、空間分布、外部環(huán)境調(diào)控，從而滿足環(huán)境污染物降解人工多細胞體系的構(gòu)建需求。此外，微生物固定化材料能夠為降解微生物提供溫和的微環(huán)境，將降解微生物與復雜的外部環(huán)境隔絕開來，對于提升降解微生物的環(huán)境耐受性及降解效率、拓展真實污染環(huán)境中的乙草胺生物修復具有重要意義。