錢紅潔，劉 霞，郭 琳，張 哲，李貴吉，楊 俐，楊艷麗

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201 2.會(huì)澤縣駕車鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，云南會(huì)澤 654218 3.大理市植保植檢站，云南大理 671003)

馬鈴薯晚疫病是由卵菌綱致病疫霉[Phytophthorainfestans(Mont.) de Bary]引起的毀滅性病害，一般年份可導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)10%～20%，發(fā)病重的年份可減產(chǎn)50%～70%，甚至絕收。防治馬鈴薯晚疫病的措施有種植抗病品種、種薯消毒、化學(xué)防治、生物防治、加強(qiáng)田間栽培管理以及預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)等，其中最經(jīng)濟(jì)有效的是種植抗病品種。由于近年來各產(chǎn)區(qū)種薯的頻繁調(diào)運(yùn)，加之晚疫病菌極易發(fā)生變異，特別是A2交配型出現(xiàn)以后，垂直抗性品種容易喪失抗性，當(dāng)晚疫病大面積發(fā)生時(shí)主要依賴化學(xué)防治[1-2]。甲霜靈為苯基酰胺類殺菌劑，是防治晚疫病的有效藥劑之一，1977年在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，該類藥劑對(duì)馬鈴薯晚疫病有很好的防治效果，具有保護(hù)兼治療的作用[3]。但長(zhǎng)期大量施用該藥劑，易使病原菌產(chǎn)生抗藥性[4]。1981年Davidse等[5]和Dowley等[6]首次報(bào)道在荷蘭和愛爾蘭發(fā)現(xiàn)甲霜靈抗性菌株，隨后全球各地區(qū)均有報(bào)道。在國(guó)內(nèi)，1998年李煒等[7]首先報(bào)道采自河北、黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅等地的馬鈴薯晚疫病菌甲霜靈敏感性情況。2010年以來，全國(guó)各省馬鈴薯產(chǎn)區(qū)甲霜靈抗性菌株比例呈逐年上升趨勢(shì)[8-10]。2018年霍超等[11]報(bào)道云南省昆明市馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)甲霜靈抗性菌株比例高達(dá)100%。但其采集地點(diǎn)和試驗(yàn)樣本量有限，不能真實(shí)反映云南省馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈敏感性的現(xiàn)狀，目前仍缺乏對(duì)云南省馬鈴薯晚疫病菌甲霜靈敏感性情況的系統(tǒng)深入研究。本研究對(duì)2018-2020年采自云南省馬鈴薯春作區(qū)晚疫病菌進(jìn)行甲霜靈敏感性測(cè)定，明確其甲霜靈抗藥性水平，為科學(xué)防治馬鈴薯晚疫病提供依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試馬鈴薯晚疫病菌共301株，由2018-2020年采自云南省春作區(qū)的馬鈴薯晚疫病樣品分離純化所得(表1)。

供試菌株編號(hào)規(guī)則：地點(diǎn)+寄主品種+(海拔)+編號(hào)。

1.2 供試藥劑

98%甲霜靈原藥，購自阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲亞砜(DMSO)，購自上海生工生物有限公司。

1.3 供試培養(yǎng)基

黑麥番茄培養(yǎng)基(1 L)：將番茄洗凈去皮用榨汁機(jī)打碎，加水1∶1稀釋，分裝至錐形瓶中，高壓滅菌鍋101 kPa、120 ℃滅菌30 min，待番茄汁冷卻后放入4 ℃冰箱中保存，備用。稱取50～60 g黑麥，加適量的水進(jìn)行高溫滅菌30 min。將已滅菌的黑麥加水榨汁機(jī)打碎，加熱煮沸后過濾，取濾液850 mL，加入150 mL番茄汁，1.2 g CaCO3及瓊脂17 g，pH調(diào)為6.5～7.0，分裝至錐形瓶中，高壓滅菌2次。倒平板，備用。

含甲霜靈質(zhì)量濃度為5 μg/mL、100 μg/mL的黑麥番茄培養(yǎng)基：98%甲霜靈原藥用滅菌的二甲亞砜溶解后配成100 mg/mL的母液，按上述方法做好黑麥番茄培養(yǎng)基，滅菌后冷卻到50 ℃，取定量母液與黑麥番茄培養(yǎng)基混勻配成所需質(zhì)量濃度的含藥培養(yǎng)基，搖勻，倒平板，備用。

含二甲亞砜50 μL/L、1 mL/L的黑麥番茄培養(yǎng)基：按上述方法做好黑麥番茄培養(yǎng)基，滅菌后冷卻到50 ℃，取定量二甲亞砜與黑麥番茄培養(yǎng)基混勻配成所需體積分?jǐn)?shù)的含藥培養(yǎng)基，搖勻，倒平板，備用。

1.4 甲霜靈敏感性測(cè)定

晚疫病菌甲霜靈敏感性測(cè)定采用菌落直徑法[12]。先用5 mm打孔器在含藥培養(yǎng)基上打孔，再切取相同直徑的待測(cè)菌株菌餅反貼于含藥平板中央，每個(gè)處理3次重復(fù)。20 ℃黑暗培養(yǎng)7 d(對(duì)照菌落直徑大于50 mm)，第8天用十字交叉法量取菌落直徑。根據(jù)含藥平板菌落直徑與空白對(duì)照菌落直徑的比值測(cè)定供試菌株的甲霜靈敏感性。甲霜靈敏感性劃分標(biāo)準(zhǔn)為：含甲霜靈5、100 μg/mL平板菌落直徑<40%對(duì)照菌落直徑為敏感菌株(S)；含甲霜靈5 μg/mL平板菌落直徑≥40%對(duì)照菌落直徑且100 μg/mL平板菌落直 徑<40%對(duì)照菌落直徑為中抗(MR)；含甲霜靈5、100 μg/mL平板菌落直徑≥40%對(duì)照菌落直徑為高抗菌株(R)。

2 結(jié)果與分析

2.1 二甲亞砜對(duì)馬鈴薯晚疫病菌生長(zhǎng)的影響

由表2可知，隨機(jī)選取來自迪慶州香格里拉市、大理州洱源縣、麗江市玉龍縣、曲靖市馬龍區(qū)和會(huì)澤縣的8個(gè)菌株進(jìn)行二甲亞砜敏感性測(cè)定，結(jié)果表明：CK菌落直徑在5.00～5.70 cm，50 μL/L DMSO菌落直徑在4.93～5.70 cm， 1 mL/L DMSO菌落直徑在4.88～5.67 cm，不同濃度的二甲亞砜對(duì)這8個(gè)馬鈴薯晚疫病菌的菌落直徑?jīng)]有顯著性差異(P>0.05)，表明溶劑二甲亞砜不會(huì)影響晚疫病菌的生長(zhǎng)，可以作為溶劑溶解98%甲霜靈原藥。

2.2 甲霜靈對(duì)馬鈴薯晚疫病菌生長(zhǎng)的影響

由表3可知，選用與二甲亞砜敏感性測(cè)定相同的8個(gè)菌株進(jìn)行甲霜靈敏感性測(cè)定，結(jié)果表明CK菌落直徑在5.00～5.70 cm，5 μg/mL甲霜靈菌落直徑在4.65～5.22 cm，100 μg/mL甲霜靈菌落直徑在0.63～4.25 cm；不同濃度的甲霜靈對(duì)這8個(gè)馬鈴薯晚疫病菌的菌落直徑有顯著性差異(P<0.05)，說明甲霜靈會(huì)影響晚疫病菌的生長(zhǎng)，甲霜靈敏感性測(cè)定試驗(yàn)具有可行性。

2.3 云南省馬鈴薯春作區(qū)晚疫病菌對(duì)甲霜靈敏感性的測(cè)定

對(duì)2018-2020年云南省馬鈴薯春作區(qū)采集的301株晚疫病菌進(jìn)行甲霜靈敏感性測(cè)定，結(jié)果表明：敏感性菌株所占比例較小，抗性菌株(高抗菌株和中抗菌株)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。其中高抗菌株為230株，占總數(shù)的76.41%，中抗菌株為64株，占21.26%，敏感性菌株為7株，占2.33%(表4)。除2020年麗江市寧蒗縣檢測(cè)到7株敏感性菌株外，其余采集地點(diǎn)抗性菌株均已達(dá)100%，表明甲霜靈在這些區(qū)域已失效不能繼續(xù)使用。

表4 2018-2020年云南省馬鈴薯春作區(qū)晚疫病菌甲霜靈敏感性Table 4 Sensitivity of metalaxyl to Phytophthora infestans in potato of spring cropping area of Yunnan province from 2018 to 2020

3 討論與結(jié)論

甲霜靈對(duì)馬鈴薯晚疫病有很好的防治效果，主要影響卵菌菌絲的生長(zhǎng)以及吸器、孢子囊的形成[13]，在生產(chǎn)上一直被廣泛應(yīng)用，但甲霜靈作用位點(diǎn)單一，長(zhǎng)期使用該藥劑極易使晚疫病菌發(fā)生突變，產(chǎn)生抗藥性。近年來，全球馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈的抗藥性日益嚴(yán)重[14]。趙志堅(jiān)等[15]研究表明，2000-2003年云南省馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈高抗、中抗和敏感菌株所占比例分別為13.2%、9.4%和77.4%。2003-2005年云南省馬鈴薯晚疫病菌甲霜靈抗性菌株比例為 20.4%[16]。2015-2016年對(duì)云南省昆明市馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)甲霜靈敏感性測(cè)定表明，高抗菌株占100%，未檢測(cè)到中抗和敏感性菌株[11]。上述研究均表明，甲霜靈抗性菌株在云南省已普遍存在，隨著甲霜靈在馬鈴薯晚疫病菌防治中的長(zhǎng)期大量使用，抗性菌株逐年上升，致使甲霜靈防控效果顯著下降。

本研究結(jié)果顯示，2018-2020年云南省馬鈴薯春作區(qū)采集的301株菌株中76.41%表現(xiàn)高抗，21.26%表現(xiàn)中抗，2.33%表現(xiàn)敏感。所有采集地區(qū)均出現(xiàn)抗性菌株，這可能與當(dāng)?shù)丶姿`施用情況密切相關(guān)，長(zhǎng)期大量施用單一殺菌劑，導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生選擇壓力，加快抗藥性群體的發(fā)展[15]；除在麗江市寧蒗縣檢測(cè)到7株甲霜靈敏感性菌株外，其余地區(qū)均未發(fā)現(xiàn)敏感性菌株，這可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)樣本容量有限，今后應(yīng)擴(kuò)大樣本容量，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更接近實(shí)際情況。本研究只對(duì)云南省馬鈴薯春作區(qū)甲霜靈敏感性進(jìn)行測(cè)定，冬作區(qū)甲霜靈敏感性情況待進(jìn)一步研究。

雖然甲霜靈敏感性測(cè)定是馬鈴薯晚疫病菌群體遺傳多樣性研究的重要組成部分，但從目前研究結(jié)果來看，甲霜靈抗藥性菌株在全國(guó)各地區(qū)已普遍存在，今后研究中除測(cè)定晚疫病菌對(duì)甲霜靈的敏感性外，還應(yīng)對(duì)其他常用殺菌劑的敏感性進(jìn)行測(cè)定，這樣才對(duì)實(shí)際生產(chǎn)更有指導(dǎo)意義。

2018-2020年云南省馬鈴薯春作區(qū)晚疫病菌對(duì)甲霜靈敏感性已達(dá)97.67%，繼續(xù)使用甲霜靈防治馬鈴薯晚疫病其效果將下降，篩選和使用新型高效殺菌劑勢(shì)在必行。