余 米，諶穎蓮，曹 敏,2，周 夢，曾德軍

(1.重慶市藥物種植研究所,重慶 408435；2.特色生物資源研究與利用川渝共建重點實驗室， 重慶 408435)

日本醫(yī)蛭(HirudonippnicaWhitman)為《中國藥典》收錄品種[1]，其含有高效抗凝血物質(zhì)—水蛭素，同時具有抗血栓、抗凝、降血脂等功效，是心腦血管疾病藥物的主要動物原材料[2]。日本醫(yī)蛭的人工養(yǎng)殖是獲取日本醫(yī)蛭藥物原材料的主要途徑，但其人工繁殖是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，解析日本醫(yī)蛭繁殖相關(guān)分子機(jī)理對提升其人工飼養(yǎng)效率及突破其人工繁殖瓶頸具有重要意義。溫度是影響日本醫(yī)蛭繁殖和生長的主要環(huán)境因子，不同溫度條件下日本醫(yī)蛭生理狀態(tài)存在明顯差異。日本醫(yī)蛭繁殖需要適宜的環(huán)境溫度，目前關(guān)于溫度對蛭類的影響研究僅限于繁殖性能和抗凍方面[3-5]，研究表明低溫能夠刺激寬體金線蛭的性腺發(fā)育[4]，但溫度對日本醫(yī)蛭的繁殖情況影響分子機(jī)制尚不明確，阻礙了對日本醫(yī)蛭繁殖相關(guān)分子機(jī)理的認(rèn)知和應(yīng)用。本研究通過設(shè)置不同的飼養(yǎng)溫度(18℃為日本醫(yī)蛭的繁殖適宜溫度，6℃為日本醫(yī)蛭的深層休眠溫度)，對日本醫(yī)蛭進(jìn)行飼養(yǎng)，利用轉(zhuǎn)錄組測序[6]及實時熒光定量PCR技術(shù)檢測不同溫度梯度下日本醫(yī)蛭頭部、環(huán)帶和肌肉組織中的基因轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)情況，對進(jìn)一步了解日本醫(yī)蛭繁殖的分子機(jī)理，加速其人工繁育，提高生產(chǎn)力具有重要意義，同時挖掘出更多與繁殖相關(guān)的基因，為深入研究日本醫(yī)蛭的繁殖分子機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

40尾日本醫(yī)蛭來自重慶市藥物種植研究所日本醫(yī)蛭繁育基地，體質(zhì)量為1.425～2.304 g，體長9.8～ 10.52 cm。分別置于6 ℃、18 ℃和 24 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)30 d，剪取肌肉、環(huán)帶和頭部組織送北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及分析。

1.2 試驗試劑

Trizol(大連寶日生物有限公司，貨號：9108)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司，貨號：K1682)；染料型熒光定量PCR Mix(大連寶日生物有限公司，貨號：RR820Q)；DL2000 Marker(大連寶日生物有限公司，貨號：3427Q)、2×Taq PCRMaster Mix(康為世紀(jì)生物有限公司，貨號：CW0690)；Goldview Ⅰ型核酸染料、異丙醇、無水乙醇、氯仿、瓊脂糖、熒光定量八連管等均由代理商購買。

1.3 RNA提取

取250 mg左右組織塊利用液氮研磨后轉(zhuǎn)至2 mL離心管中，加入1 mL Trizol冰上裂解5 min并搖勻，加入200 μL的氯仿，充分混勻后 12 000 r/min 離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入等體積的異丙醇，冰育 20 min，取出后10 000 r/min 離心10 min，去上清液并晾干，加入400 μL 75%無水乙醇洗滌，7 500 r/min 離心5 min后取出晾干，加入50 μL的DEPC水熔解，置于85 ℃水浴鍋內(nèi)5 min后放置-80 ℃冰箱保存。

1.4 cDNA合成

取1 μg的RNA樣品利用DNA酶處理2 min后，75 ℃處理 5 min去酶活，加入多聚dT引物和隨機(jī)引物各1 mol/L(10 μmol/L)，65 ℃孵育5 min后加入dNTP、反轉(zhuǎn)錄酶、反應(yīng)Buffer及滅菌水，42 ℃孵育1 h，75 ℃處理5 min去酶活，cDNA樣品保存于-20 ℃冰箱。

1.5 引物設(shè)計及qPCR反應(yīng)

利用Primer 5軟件及NCBI數(shù)據(jù)庫序列對基因進(jìn)行qPCR引物設(shè)計，詳細(xì)信息見表1，使用20 μL反應(yīng)體系，包括10 μL Mix、上下游引物各1 mol/L(10 μmol/L)、cDNA模板1 μL、滅菌水 7 μL，置于PCR儀或熒光定量PCR儀反應(yīng)；反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min 循環(huán)內(nèi)95 ℃變性 30 s，60 ℃退火和延伸45 s，反應(yīng)40 個循環(huán)；熔解曲線繪制程序為60 ℃ 穩(wěn)定1 min，每5 s升高 0.5 ℃并記錄一次熒光值，至95 ℃結(jié)束，繪制熔解曲線圖，反應(yīng)產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小并送樣測序檢測引物特異性。

表1 基因qPCR擴(kuò)增引物序列及信息Table 1 Gene qPCR amplification primer sequence and information

通過設(shè)計的引物對各待測基因進(jìn)行引物PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，結(jié)果顯示各基因擴(kuò)增反應(yīng)條帶單一，未出現(xiàn)非特異擴(kuò)增條帶，能夠用于qPCR反應(yīng)來檢測各待測基因的表達(dá)情況(圖1)，同時各基因qPCR擴(kuò)增熔解曲線峰單一(圖2)，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與預(yù)期一致，說明設(shè)計的qPCR引物能夠準(zhǔn)確檢測各待測基因在各樣品中的表達(dá)情況。

1.6 蛋白功能域預(yù)測及miRNA親和預(yù)測

使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測假定蛋白包含的功能域，分析假定蛋白的功能；使用PSI-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對基因氨基酸序列；使用SWChen 2.0(https://ylchen-swchen.lofter.com/)分析非編碼RNA對miRNAs的結(jié)合情況。

1.7 統(tǒng)計分析

使用2-δδ算法[7-9]計算各基因在各組織中的相對表達(dá)情況；使用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，兩組數(shù)據(jù)之間的比較使用Student-t檢驗，用“*”和“**”分別表示差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)；多組數(shù)據(jù)之間的比較使用鄧肯法檢測，不含有相同大寫字母表示差異極顯著 (P<0.01)，不含有相同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)；利用Graph Pad 8.0繪制基因組織表達(dá)熱圖和柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序候選基因表達(dá)情況

通過對6 ℃、18 ℃、24 ℃ 3種不同溫度條件下飼養(yǎng)的日本醫(yī)蛭頭部、環(huán)帶和肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，選取11 個在各條件下表達(dá)具有差異的基因繪制表達(dá)熱圖(圖3)并通過對基因序列比對進(jìn)行功能注釋(表2)，結(jié)果顯示在 6 ℃條件下基因G1～G4，G7，G9，G11，G13，G14總體表達(dá)下調(diào)；G5，G6在總體表達(dá)上調(diào)；在18 ℃條件下G1、G2、G4、G7、G9、G13和G14在頭部組織表達(dá)相對較高，G6和G11在環(huán)帶表相對較高，G3和G5在肌肉組織表達(dá)相對較高；對11 個基因的功能進(jìn)行注釋結(jié)果顯示，11個基因主要涉及肌球蛋白、無脊椎連接蛋白9以及一些假定蛋白和非特征蛋白。

表2 日本醫(yī)蛭基因功能注釋Table 2 Function note of H.nippnica gene

2.2 熒光定量PCR對待測基因表達(dá)驗證

為進(jìn)一步驗證日本醫(yī)蛭在不同溫度條件下的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，對6 ℃、18 ℃、 24 ℃ 3種溫度下日本醫(yī)蛭頭部、環(huán)帶、肌肉組織中的11 個待測基因進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，檢測11個待測基因的表達(dá)情況(圖4～6)。結(jié)果顯示在6 ℃和24 ℃條件下飼養(yǎng)日本醫(yī)蛭 30 d后，在日本醫(yī)蛭肌肉組織中G1和G2基因在 6 ℃條件下的表達(dá)極顯著低于24 ℃條件下的表達(dá)(P<0.01)；在日本醫(yī)蛭頭部中6 ℃和24 ℃條件下G13基因表達(dá)差異不顯著(P>0.05)，G14基因在6 ℃條件下的表達(dá)極顯著低于24 ℃條件下的表達(dá)(P<0.01)；在日本醫(yī)蛭環(huán)帶中G4和G5基因6 ℃飼養(yǎng)條件下的表達(dá)顯著高于24 ℃飼養(yǎng)條件(P<0.05)，在6 ℃飼養(yǎng)條件下，G3基因在環(huán)帶中的表達(dá)顯著低于24 ℃飼養(yǎng)條件(P< 0.05)。在6 ℃、18 ℃和24 ℃飼養(yǎng)條件下，對G6、G7、G9、G11基因分別測定其在日本醫(yī)蛭的環(huán)帶和頭部的表情況(圖6)，結(jié)果顯示，在日本醫(yī)蛭的環(huán)帶中G6基因的表達(dá)隨著溫度的升高而極顯著降低(P<0.01)；而在日本醫(yī)蛭的頭部G7和G9基因隨溫度的升高呈現(xiàn)表達(dá)增高趨勢，其中G7在24 ℃飼養(yǎng)條件下極顯著高于18 ℃和6 ℃條件(P<0.01)，G9在18 ℃和24 ℃ 飼養(yǎng)條件下顯著高于6 ℃條件(P<0.05)，但G11基因隨溫度的升高表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢，其中24 ℃飼養(yǎng)條件下G11基因在頭部的表達(dá)極顯著低于6 ℃條件(P<0.01)。

2.3 假定蛋白功能域預(yù)測及非編碼RNA對miRNA親和預(yù)測

由于G2、G3、G6、G7、G9和G11的的注釋屬于假定蛋白，為進(jìn)一步了解它們的功能，對以上6種測序序列進(jìn)行開放閱讀框翻譯，將獲得的蛋白序列進(jìn)行功能域預(yù)測了解6種假定蛋白可能有關(guān)的功能，結(jié)果顯示，僅有G6、G9和G11呈現(xiàn)出高置信度的功能域，包括G6和G9蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域以及G11蛋白的核糖體功能域L31e(圖7)，暗示G6和G9可能為跨膜蛋白，而G11與核糖體蛋白相關(guān)，具體的功能判斷需要進(jìn)一步分析，而G7沒有預(yù)測到相關(guān)功能域，其他置信度較低功能域已列出見表3，G13基因?qū)儆跊]有蛋白特征的序列，檢測其對miRNA的親和程度來預(yù)測其功能，列出親和排名前十位miRNA(圖 8)。

表3 編碼基因蛋白序列及功能域預(yù)測Table 3 Prediction of protein sequences and functional domains of coding genes

3 討 論

日本醫(yī)蛭俗稱水蛭、日本醫(yī)水蛭、稻田醫(yī)蛭，隸屬于醫(yī)蛭行亞目(Hirudiniformes Caballero)、醫(yī)蛭科(Hirudinidae Whitman)、醫(yī)蛭屬(Hirudo)，在中國南北多省均有分布，由于其含有高效抗凝血物質(zhì)—水蛭素，是心腦血管疾病藥物的主要動物原材料[2,10]，近年來隨著中藥材市場和藥企需求的增加，過度捕撈加之天然水域水質(zhì)的改變，使得天然水域日本醫(yī)蛭的資源量減少，日本醫(yī)蛭的人工繁育是獲取日本醫(yī)蛭原材料的主要途徑，而目前對日本醫(yī)蛭的繁殖機(jī)理研究尚屬空白，而日本醫(yī)蛭的繁殖需要在適宜的溫度條件下進(jìn)行，因此掌握不同溫度梯度下日本醫(yī)蛭各基因的表達(dá)情況對于解析日本醫(yī)蛭的繁殖分子機(jī)理具有重要意義。

通過設(shè)置6 ℃、18 ℃、24 ℃ 3種溫度梯度的飼養(yǎng)條件，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序的方法對基因在日本醫(yī)蛭肌肉組織、環(huán)帶和頭部的表達(dá)差異進(jìn)行測定，對其中表達(dá)差異的11個基因(表2)進(jìn)行表達(dá)驗證，基因的組織表達(dá)轉(zhuǎn)錄組測序熱圖結(jié)果顯示，基因G1～G4和G7，G9，G11，G13，G14在低溫條件下總體表達(dá)下調(diào)，在低溫條件下變溫動物的代謝情況會相對變慢，基于低溫條件下表達(dá)量減少推測是代謝變慢造成[4,11]，而G5和G6在低溫條件下總體表達(dá)上調(diào)，暗示G5和G6基因可能為刺激日本醫(yī)蛭性腺發(fā)育的繁殖相關(guān)基因；18 ℃是日本醫(yī)蛭的最適繁殖溫度，在18 ℃飼養(yǎng)條件下不同組織中G1、G2、G4、G7、G9、G13和G14在頭部組織表達(dá)相對較高，G6和G11在環(huán)帶表相對較高，G3和G5在肌肉組織表達(dá)相對較高，日本醫(yī)蛭的頭部主要參與神經(jīng)和體液的調(diào)控，因此在頭部組織高表達(dá)的基因可能涉及其繁殖調(diào)控，而環(huán)帶與日本醫(yī)蛭的繁殖具有較大的關(guān)聯(lián)，G6和G11的高表達(dá)暗示G6和G11基因與日本醫(yī)蛭的繁殖相關(guān)，日本醫(yī)蛭的肌肉組織能夠影響其活動和代謝狀況，反映機(jī)體的適應(yīng)能力及對疾病的抵抗力，因此G3和G5可能與其適應(yīng)性和疾病抗性相關(guān)；轉(zhuǎn)錄組學(xué)的表達(dá)測序結(jié)果為探究基因在不同組織及不同溫度條件下的表達(dá)情況及挖掘日本醫(yī)蛭繁殖相關(guān)分子，為研究日本醫(yī)蛭的繁殖分子機(jī)理提供參考[6]。為進(jìn)一步驗證不同溫度下各基因的表達(dá)情況，利用實時熒光定量PCR試驗進(jìn)一步驗證11個基因的表達(dá)情況(圖4～6)，結(jié)果顯示，低溫條件下G1、G2、G3、G14在肌肉、環(huán)帶和頭部組織中均表達(dá)下調(diào)，G4和G5在環(huán)帶中表達(dá)上調(diào)，低溫條件下基因的表達(dá)上調(diào)暗示G4和G5與日本醫(yī)蛭繁殖相關(guān)，同時G6基因在環(huán)帶中的表達(dá)情況隨溫度的升高而降低，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，進(jìn)一步暗示指出G6基因與日本醫(yī)蛭的繁殖密切相關(guān)；G7在頭部中6 ℃和18 ℃表達(dá)極顯著低于24 ℃，而6 ℃和18 ℃之間表達(dá)差異不明顯，且G11在頭部中的表達(dá)隨溫度的升高而降低，G11可能屬于繁殖促進(jìn)基因，但需要進(jìn)一步試驗驗證；G13在頭部低溫條件下表達(dá)變化差異不顯著，G9在頭部6 ℃和18 ℃之間表達(dá)差異顯著，但其他溫度比較不顯著，G9和G13的的功能還需要進(jìn)一步實驗驗證，通過熒光定量對基因表達(dá)情況檢測結(jié)果指出G6基因在日本醫(yī)蛭的環(huán)帶中表達(dá)隨溫度的升高而降低，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，指出了G6基因在日本醫(yī)蛭繁殖過程中的重要性，同時G4和G5在環(huán)帶中低溫條件下表達(dá)上調(diào)，也指明其繁殖關(guān)聯(lián)性，但與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果不一致，需要進(jìn)一步的試驗驗證，G11基因在頭部組織中低溫條件下表達(dá)上調(diào)，也暗示G11基因?qū)θ毡踞t(yī)蛭的繁殖具有促進(jìn)作用，其他基因的功能需要進(jìn)一步的試驗驗證。蛋白的功能域結(jié)構(gòu)[12]與非編碼RNA對miRNA的親和能力情況能夠反映出未知蛋白和非編碼RNA序列可能的功能[8,13]，為進(jìn)一步分析未注釋的G2、G3、G6、G7、G9、G11和G13基因，對其假定蛋白進(jìn)行功能域預(yù)測和非編碼RNA序列進(jìn)行miRNA親和能力評估，探究未注釋基因的功能情況[8,13]，結(jié)果顯示G6 和G9存在重復(fù)的轉(zhuǎn)膜域結(jié)構(gòu)，G11具有一個核糖體蛋白域結(jié)構(gòu)，可能由于物種之間的差異性，而其他假定蛋白沒有顯著的功能域結(jié)構(gòu)，不顯著的功能域列于表3為其研究提供參考，假定蛋白功能域預(yù)測暗示G6和G9屬于膜蛋白，而G11與蛋白合成相關(guān)，為G6、G9和G11的功能研究提供參考，通過進(jìn)一步的核酸和氨基酸BLAST比對發(fā)現(xiàn)，由于水蛭類物種序列數(shù)據(jù)核酸信息較少，物種之間的核酸序列差異較大，G6、G9和G11核酸序列與GeneBank比對相似度較低，通過蛋白PSI-BLAST(Position-Specific Iterated BLAST)比較顯示，G6與脂肪酸去飽和酶(Omega-3 desaturase-like B[Platynereisdumerilii] ATV93525.1)具有較高的相似性，G9與水通道蛋白(Aquaporin [Eiseniaandrei] CAX48970.1)具有較高相似性，G11與核糖體蛋白(Ribosomal protein rpl31[Eurythoecomplanata] ABW23230.1)具有較高相似性，在特種生物高通量測序中，可通過序列比對的方法預(yù)測新基因的功能，但由于低等物種的多樣性及日本醫(yī)蛭序列信息的不完整，導(dǎo)致對基因的注釋不完整，PSI-BLAST比對可對保守的氨基酸序列區(qū)域給出評分而并非整個蛋白序列比對，能夠消除一部分由物種差異導(dǎo)致的非功能保守區(qū)域的不相識導(dǎo)致的低評分，但比對結(jié)果需要進(jìn)一步試驗驗證，由比對結(jié)果可知，在低溫條件下水蛭可能增加G6脂肪酸去飽和酶的表達(dá)量來增加細(xì)胞脂膜磷脂脂肪酸鏈的不規(guī)則程度，增加細(xì)胞膜的流動性降低脂肪酸凝固點，有利于低溫環(huán)境下生存，同時去飽和酶的表達(dá)量升高也有較大幾率增加不飽和脂肪防酸的形成，有利于固醇類、甾類等性激素的合成；生物體內(nèi)水分的變化能夠讓生物適應(yīng)環(huán)境溫度的變化， G9基因在低溫條件下的平均表達(dá)量值減少(P>0.05)，能夠改變細(xì)胞水分含量，使其適應(yīng)更為極端的低溫環(huán)境；低溫條件下生物的代謝活動會減少，G11為核糖體亞基的一部分，在低溫條件下表達(dá)量出現(xiàn)升高的狀況，可能與抗凍蛋白的合成相關(guān)，但具體需要進(jìn)一步研究證明；非編碼RNA在細(xì)胞的繁殖調(diào)控中具有重要作用[14]，G13基因沒有蛋白的翻譯特征，屬于非編碼RNA序列[15]，非編碼RNA可通過親和miRNA來抑制miRNA對下游蛋白的表達(dá)調(diào)控，而影響動物的繁殖情況[13-14]，通過SWChen 2.0程序[8]預(yù)測G13基因?qū)iRNA的親和程度和結(jié)合位置(圖8)，與miRNA親和程度較強(qiáng)的前十個miRNAs列于表3為其進(jìn)一步研究提供參考。

4 結(jié) 論

通過熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，G4～G6基因在環(huán)帶中的表達(dá)隨溫度的升高而降低，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，6 ℃條件下日本醫(yī)蛭基因 G4～G6表達(dá)量提高，G4～G6與繁殖具有較強(qiáng)的相關(guān)性。