茍妮娜,鐘明智，王開鋒

(1.陜西省動(dòng)物研究所,陜西省秦嶺珍稀瀕危動(dòng)物保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 710032；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100)

多鱗白甲魚(Onychostomamacrolepis)又稱多鱗鏟頜魚，是一種雜食性淡水經(jīng)濟(jì)魚類，隸屬鯉形目(Cypriniformes)，鯉科(Cyprinidae)，鲃亞科(Barbinae)，白甲魚屬(Onychostoma)[1]。該魚常見于秦巴山區(qū)、鄂西山地及魯中南山地[2]，因其味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富而深受消費(fèi)者喜愛[3]。近年來，受氣候變化及水利工程影響，多鱗白甲魚野生資源量呈下降趨勢(shì)[4]，被《中國(guó)脊椎動(dòng)物紅色名錄》評(píng)估為VU(易危)等級(jí)[5]。因此，具有重要的種質(zhì)資源保護(hù)價(jià)值及人工養(yǎng)殖開發(fā)前景。隨著人工養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展，多鱗白甲魚養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大，然而各種疾病也隨之而來?？股仡愃幬锇枇贤段挂约盎瘜W(xué)試劑溶液浸浴是目前普遍采用的治療方法[6]，然而藥物療法不但污染水質(zhì)，而且威脅水產(chǎn)品健康。因此，如何提高魚類自身免疫能力及抗病力成為近年來水產(chǎn)品健康養(yǎng)殖的研究熱點(diǎn)。有研究表明，腸道微生物菌群參與魚類營(yíng)養(yǎng)[7]、免疫[8]和疾病爆發(fā)[9-10]等一系列生理過程。

動(dòng)物的腸道由復(fù)雜的動(dòng)態(tài)微生物生態(tài)系統(tǒng)組成，從營(yíng)養(yǎng)、生理和病理學(xué)的角度來看，腸道微生物非常重要。腸道微生物菌群在宿主體內(nèi)具有多種功能，通過促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、防止感染源寄居、能量穩(wěn)態(tài)的維持和正常的粘膜免疫，它們對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)和健康的重要性在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)得到很好證實(shí)[11-13]。魚類的腸道微生物通常來自周圍的水環(huán)境，土壤、沉積物以及飼料，這些微生物聚集在腸道中形成腸道微生物群落[14-18]。16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)打開了微生物研究的新思路，運(yùn)用基因組學(xué)方法獲得的微生物數(shù)據(jù)信息比傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法更加高效、準(zhǔn)確。本研究通過宏基因組測(cè)序，探討野生和養(yǎng)殖多鱗白甲魚組成及其腸道微生物群落多樣性，以期為多鱗白甲魚的健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 采集樣本

2019年4月，分別于黑河多鱗白甲魚國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)(33°58′38″N，108°08′54″E，陜西周至)和天源生態(tài)養(yǎng)殖公司(陜西鎮(zhèn)坪)采集野生和人工養(yǎng)殖多鱗白甲魚樣品。野外采用電捕法，養(yǎng)殖場(chǎng)采用撒網(wǎng)法捕魚。多鱗白甲魚生物學(xué)信息見表1。

表1 樣本生物學(xué)信息Table 1 Biological characteristics of samples

1.2 腸道內(nèi)容物提取

分別將野生和養(yǎng)殖兩組參試魚(每組6尾，共12尾)在實(shí)驗(yàn)室無菌條件下進(jìn)行解剖。采用 0.9%生理鹽水沖洗魚體表面后，再使用蒸餾水進(jìn)行漂洗。解剖后，將魚的腸道分離出來置于培養(yǎng)皿中，縱向剪開小腸，收集腸道內(nèi)容物(3尾混合)，采用5 mL凍存管保存并標(biāo)記后，立即放入液氮中冷凍，隨后置于-80 ℃ 超低溫冰箱中，備用。養(yǎng)殖樣品編號(hào)：養(yǎng)殖1(G-B-YANG)，養(yǎng)殖2(G-F-YANG)；野生樣品編號(hào)：野生1(G-K-YE)，野生2(G-I-YE)。

1.3 樣品的預(yù)處理

分別稱取0.25 g樣品，放入2 mL的無菌離心管中，采用OMEGA公司的試劑盒(E.Z.N.ATM磁結(jié)合土壤DNA試劑盒)提取DNA。

1.4 PCR檢測(cè)

利用Qubit 3.0 DNA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，樣品DNA達(dá)到檢測(cè)要求后，委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行腸道微生物16S rRNA V3、V4區(qū)宏基因組分類測(cè)序。引物序列為：341F:5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′, 805R:5′-GACTACHVGGGTATCT AATCC-3′。 PCR反應(yīng)總體積為30 μL：Genomic DNA10～20 ng， Bar-PCR primer F(10 μmol/L) 1 μL，Primer R (10 μmol/L) 1 μL，2×Taqmaster Mix 15 μL，加入滅菌雙蒸水至30 μL。熱循環(huán)反應(yīng)條件為：94 ℃ 變性3 min，94 ℃ 變性30 s，45 ℃ 退火20 s， 65 ℃ 延伸30 s， 5個(gè)循環(huán)； 94 ℃ 變性20 s， 55 ℃ 退火20 s，72 ℃ 延伸30 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳純化 回收。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

1.5.1 OUT分類分析 OTU (Operational Taxonomic Units) 指的是分類單元。先根據(jù)序列間的距離將全部樣本進(jìn)行聚類，再按照序列間的相似性將樣本分成不同的 OUT。OTU的代表性序列為豐度最高的序列。

1.5.2 多樣性指數(shù)分析 腸道微生物菌群的多樣性和豐度情況可以通過幾種常見的多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估，這些指標(biāo)來源于生態(tài)學(xué)中評(píng)價(jià)環(huán)境微生物群落多樣性的方法。

群落多樣性指數(shù)：Shannon指數(shù)[19]，微生物多樣性指數(shù)之一，其數(shù)值越大，表明群落多樣性越高。Simpson指數(shù)[20]，與Shannon指數(shù)不同，Simpson指數(shù)數(shù)值越大，表明群落多樣性越低。覆蓋度，覆蓋率越高，表明樣本序列未被檢測(cè)出的概率越低，說明測(cè)序結(jié)果能夠反映樣本的真實(shí) 情況。

群落豐度指數(shù)：ACE指數(shù)[21]，用于估算微生物群落總OUT數(shù)，ACE 指數(shù)與微生物群落豐度呈正比。Chao1指數(shù)[22]，與ACE 指數(shù)類似，同樣用于估算群落微生物總OUT數(shù)。

1.5.3 物種分類學(xué)分析 對(duì)檢測(cè)樣本序列進(jìn)行分類學(xué)分析，分別統(tǒng)計(jì)樣本在門(Phylum)、屬 (Genus)兩個(gè)分類層級(jí)水平的微生物群落組成。

1.5.4 PCA分析(主成分分析) 主成分分析[23]是一種數(shù)據(jù)簡(jiǎn)化分析技術(shù)，在降低復(fù)雜數(shù)據(jù)維數(shù)的同時(shí)還保留數(shù)據(jù)中對(duì)方差貢獻(xiàn)最大的特征。樣本間距離越近，則表示這兩個(gè)樣本的組成越相似。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道微生物16S rRNA測(cè)序

測(cè)序后各樣本信息統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表2和表3。從表2可知，各樣本質(zhì)量控制后的序列平均長(zhǎng)度在410～420 bp，表明樣品滿足高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析要求。通過Barcode對(duì)樣品序列進(jìn)行質(zhì)量控制，去除非特異性擴(kuò)增序列及嵌合體，因此，從表3能夠發(fā)現(xiàn)，處理后各樣本的序列數(shù)小于處理前的序列數(shù)。

表2 樣本數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics data of samples sequencing

表3 去除嵌合體與靶區(qū)域外序列統(tǒng)計(jì)Table 3 Removal chimera and target out of sequence symbionts

2.2 腸道微生物OUT分布韋恩圖

不同樣品用不同顏色表示，圖中數(shù)字代表特異或共有的OTU數(shù)。韋恩圖構(gòu)建所需樣本數(shù)一般為2～5個(gè)。如圖1所示，4個(gè)樣品腸道微生物OTU總數(shù)為8 252，養(yǎng)殖多鱗白甲魚腸道微生物的OUT數(shù)小于野生多鱗白甲魚。養(yǎng)殖1(G-B-YANG)和養(yǎng)殖2(G-F-YANG)的OUT數(shù)相差較小，分別為1 443和1 331，而野生1(G-K-YE)和野生2(G-I-YE)的OUT數(shù)相差較大，分別為 3 938和1 933。

2.3 腸道微生物群落多樣性指數(shù)分析

由表4可知，養(yǎng)殖1和養(yǎng)殖2的ACE和Chao1指數(shù)大于野生1和野生2，說明養(yǎng)殖多鱗白甲魚腸道微生物的物種豐度大于野生多鱗白甲魚。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，野生2樣品腸道微生物群落Shannon 指數(shù)最大，而Simpson指數(shù)最小，表明該樣品生物多樣性最高。如表4所示，全部樣品的覆蓋度指數(shù)范圍在0.94～0.98，表明各樣品序列幾乎都被檢測(cè)出來，沒有被檢測(cè)出的概率很小。說明本試驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，可以反映野生和養(yǎng)殖多鱗白甲魚腸道微生物群落組成的多樣性。

表4 樣本Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)Table 4 Alpha indices of samples

隨機(jī)抽取檢測(cè)樣本序列，將抽取的序列數(shù)與其代表的OUT數(shù)形成稀釋曲線 (Rarefaction curve)(圖2)。曲線呈上升趨勢(shì)時(shí)，表明增加測(cè)序樣本數(shù)還能繼續(xù)產(chǎn)生新的OUT；而曲線趨于平坦時(shí)，則表明繼續(xù)增加檢測(cè)樣本也不會(huì)產(chǎn)生更多新的OUT，說明被檢測(cè)數(shù)據(jù)量較為合理。

2.4 腸道微生物群落物種分類

由表5可知，人工養(yǎng)殖的多鱗白甲魚腸道菌群主要由變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和廣古菌門(Euryarchaeota)等菌門組成；野生多鱗白甲魚腸道菌群主要由變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)和衣原體門(Chlamydiae)等4個(gè)門組成。而在屬的分類水平上(表6)，人工養(yǎng)殖多鱗白甲魚腸道微生物中，優(yōu)勢(shì)菌群為甲基桿菌屬(Methylobacterium)、埃希菌屬/志賀菌屬(Escherichia/Shigella)和乳桿菌屬(Lactobacillus)；野生多鱗白甲魚腸道中優(yōu)勢(shì)菌群為鯨桿菌屬(Cetobacterium)、支原體屬(Mycoplasma)和嗜衣原體屬(Chlamydophila)。

表5 基于門分類水平上各樣本腸道微生物優(yōu)勢(shì)群落占比Table 5 Microbial dominant flora atphylum level %

表6 基于屬分類水平上各樣本腸道微生物優(yōu)勢(shì)群落占比Table 6 Microbial dominant flora at gene level %

2.5 腸道微生物群落結(jié)構(gòu)主成分分析

從圖3可以看出，野生1和野生2樣品出現(xiàn)在第一象限，而養(yǎng)殖1和養(yǎng)殖2 樣品是在第三象限，表明野生和養(yǎng)殖多鱗白甲魚的腸道微生物組成不同，二者之間存在明顯差異。

3 討 論

3.1 魚類腸道微生物組成及影響因素

多鱗白甲魚腸道菌群主要有變形菌門 (Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)，這與Gajardo等[24]、Gatesoupe[25]和Saha等[26]的研究結(jié)果相似，說明細(xì)菌是魚類腸道微生物菌群的優(yōu)勢(shì)群落。魚類的腸道微生物菌群組成受外源性和內(nèi)源性因素的雙重影響，如食性、腸道結(jié)構(gòu)、水環(huán)境溫度、養(yǎng)殖條件以及外界壓力等[27-28]。通過16S rRNA基因組測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)，野生和人工培育的多鱗白甲魚腸道微生物菌群組成差異較大，且野生魚之間也存在一定差異，在孔雀魚(Trinidadianguppies)及褐點(diǎn)石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus)的研究中也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果[29-30]?？赡苁且?yàn)橐吧~與人工養(yǎng)殖魚的攝食環(huán)境不同，食物結(jié)構(gòu)具有差異。在野外，多鱗白甲魚常見于水流清澈、湍急，底質(zhì)為礫石的山間溪流中，水體溶氧豐富，水質(zhì)清潔度高。野生多鱗白甲魚以水生昆蟲、昆蟲幼體和附著在石塊上的藻類以及掉落水中的植物碎片等為食。人工培育主要使用土質(zhì)池塘或水泥池，由于養(yǎng)殖成本和養(yǎng)殖環(huán)境條件制約，養(yǎng)殖密度較高，導(dǎo)致水體透明度降低，氨氮等代謝產(chǎn)物也會(huì)對(duì)水質(zhì)產(chǎn)生一定程度的負(fù)面影響。人工養(yǎng)殖池塘中天然餌料匱乏，多鱗白甲魚主要攝食人工配合飼料。同時(shí)，受野外條件限制，野生魚類的攝食行為也不如人工飼喂的魚類規(guī)律，說明攝食條件和習(xí)慣對(duì)魚的腸道菌群組成有重要影響[31-33]。此外，野生魚與人工養(yǎng)殖多鱗白甲魚生活的水體環(huán)境不同，也會(huì)造成腸道微生物群落的不同。Giatsis 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚(Tilapia)腸道微生物群落與水體微生物組成具正相關(guān)性，表明魚類在適應(yīng)環(huán)境過程中，腸道微生物具有積極作用。當(dāng)各種不同的化學(xué)物質(zhì)、抗生素、殺蟲劑、除草劑和殺蟲劑等污染物進(jìn)入水生動(dòng)物的消化道，它們可以極大地影響優(yōu)勢(shì)腸道微生物群的組成，并可能導(dǎo)致個(gè)別物種從整個(gè)微生物群落中消失[35-37]。

3.2 魚類腸道微生物多樣性及作用

本研究中，野生多鱗白甲魚腸道微生物的OUT數(shù)大于養(yǎng)殖多鱗白甲魚。表明野生多鱗白甲魚腸道微生物群落豐度較大。可能是由于野外和人工培育的生境和攝食等方面的不同，導(dǎo)致魚類腸道微生物群落多樣性差異[38-39]。腸道微生物菌群在宿主營(yíng)養(yǎng)和健康方面具有重要作用[40]。研究表明，魚類的腸道微生物通過產(chǎn)生與哺乳動(dòng)物相似的維生素、氨基酸、消化酶和代謝物，參與宿主的營(yíng)養(yǎng)和生理過程[41-43]。野生多鱗白甲魚腸道中優(yōu)勢(shì)菌群為鯨桿菌屬(Cetobacterium)，Tsuchiya等[44]研究發(fā)現(xiàn)鯨桿菌屬微生物可以合成維生素B12，維生素B12不僅促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的生物合成，還參加碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的分解代謝，是人和動(dòng)物體內(nèi)必不可少的微量元素。乳桿菌屬(Lactobacillus)是人工養(yǎng)殖多鱗白甲魚腸道微生物中的優(yōu)勢(shì)菌群。研究發(fā)現(xiàn)，在人工培育系統(tǒng)中，乳桿菌屬(Lactobacillus)會(huì)發(fā)展成為鯉魚腸道微生物的優(yōu)勢(shì)菌群并具有穩(wěn)定性[45]，與本研究結(jié)果一致。這可能是由于乳桿菌可以提高魚類免疫力，從而更好的適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。本研究表明，魚類腸道微生物菌群具有營(yíng)養(yǎng)及調(diào)節(jié)消化道免疫功能的作用。然而，與恒溫動(dòng)物相比，魚類的腸道生態(tài)環(huán)境復(fù)雜多變，因此，腸道微生物在魚類營(yíng)養(yǎng)中的確切作用還有待進(jìn)一步探究。