沈丹丹，劉 妍，胡 娟，袁應(yīng)華（同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200072）

白喉是由白喉棒狀桿菌引起的傳染性較強(qiáng)的急性呼吸系統(tǒng)傳染病，以局部灰白色假膜和全身毒血癥為臨床特征，嚴(yán)重感染者可能會(huì)擴(kuò)散至心臟和神經(jīng)系統(tǒng)[1]，病死率較高。人類是白喉棒狀桿菌的唯一宿主，攜帶毒力菌株的患者是唯一的傳染源，主要通過(guò)密切的身體接觸和呼吸飛沫傳播發(fā)生人際傳播[2]。

隨著擴(kuò)大免疫接種實(shí)施和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的改善，白喉發(fā)病率已穩(wěn)步下降。盡管如此，在某些疫苗覆蓋率低、衛(wèi)生條件差和人群密集地區(qū)白喉仍然在流行暴發(fā)，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的一份報(bào)告，全球接種疫苗后白喉病例的80%以上來(lái)自印度和印度尼西亞[3]。中國(guó)自1978年實(shí)施計(jì)劃免疫后，白喉的發(fā)病率得到了極大控制，2007年后全國(guó)就沒(méi)有白喉病例報(bào)告[4]，截止2019年上海市連續(xù)41年無(wú)白喉病例報(bào)告[5]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道了[6-8]部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)非產(chǎn)毒力白喉棒狀桿菌攜帶者病例，提示我們?cè)谟?jì)劃免疫當(dāng)下仍要重視白喉的存在。本文針對(duì)我院2020年6月2日收治入院的1 例白喉棒狀桿菌攜帶者的病例特點(diǎn)及病原學(xué)診斷做一簡(jiǎn)要的分析。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 病例來(lái)源：病例來(lái)源于上海市第十人民醫(yī)院神經(jīng)外科住院患者，該患者于2020年6月4日采集痰液標(biāo)本分離培養(yǎng)，結(jié)果經(jīng)鑒定為白喉棒狀桿菌。

1.1.2 流行病調(diào)查：按照要求上報(bào)院感染與控制辦公室，對(duì)患者進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)個(gè)案調(diào)查和樣本采集，同時(shí)收集病例資料和流行病學(xué)史，對(duì)密切接觸者進(jìn)行調(diào)查。由于患者入院時(shí)即為昏迷狀態(tài)，詢問(wèn)其家屬完成相關(guān)的流行病接觸史、接種防疫史。

1.2 儀器與試劑 VITEK MS 質(zhì)譜儀（法國(guó)生物梅里埃公司），WalkAway 96 Plus 微生物分析系統(tǒng)（德國(guó)SIEMENS 公司），mNGS 及16S rDNA 測(cè)序（北京博奧醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所），Veriti 96 Well PCR 熱循環(huán)儀（Applied Biosystems），毒力基因toxA 和toxB 引物（上海生物工程公司），頭孢曲松藥敏條（鄭州安圖），白喉棒狀桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA（上海疾病預(yù)防控制中心）。

1.3 方法

1.3.1 普通培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗(yàn)：6月4日和8日分別采集痰液標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)及鑒定。痰液標(biāo)本接種血平板、麥康凱及巧克力平板，35℃，5ml/dl CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h，挑取可疑菌落涂片鏡檢觀察形態(tài)。挑取單個(gè)菌落涂于靶板，參照VITEK MS 梅里埃質(zhì)譜儀操作規(guī)程進(jìn)行蛋白峰分析。藥敏試驗(yàn)采用WalkAway 96 Plus 微生物分析系統(tǒng)，結(jié)果按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)判讀[9]。

1.3.2 基因測(cè)序：采集痰液標(biāo)本送檢北京博奧醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所進(jìn)行宏基因測(cè)序（metagenomic sequencing，mNGS），對(duì)該標(biāo)本中所有微生物DNA 或RNA 進(jìn)行全基因組分析，送檢分離培養(yǎng)的白喉棒狀桿菌純菌株行16S rDNA 測(cè)序，獲得該菌株的屬信息。

1.3.3 毒力基因檢測(cè)：采用普通PCR 對(duì)該病例菌株樣本進(jìn)行toxA 和toxB 毒力基因檢測(cè)，toxA和toxB 毒力基因引物參照文獻(xiàn)[10]。擴(kuò)增條件為94℃ 5min，94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，循環(huán)30 次，72℃延長(zhǎng)5min。同時(shí)采用超純水做陰性對(duì)照，白喉棒狀桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA 為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 病例診治及調(diào)查結(jié)果 患者于2020年6月2日凌晨4 時(shí)在家中起床后突發(fā)嘔吐后昏迷倒地，入院后診斷為動(dòng)脈瘤破裂伴蛛網(wǎng)膜下腔出血，急診行腦血管造影備顱內(nèi)動(dòng)脈瘤栓塞術(shù)，術(shù)后見(jiàn)腦室鑄型，立即給予腦室外引流術(shù)?；颊呷朐汉笳麄€(gè)病程一直處于昏迷狀態(tài)，術(shù)后予以氣管插管并呼吸機(jī)輔助通氣中，6月4日通過(guò)吸痰方式獲取少量膿性稀痰送檢，檢出白喉棒狀桿菌（1+）和流感嗜血桿菌，患者入院后無(wú)發(fā)熱，其余咳痰、胸悶、咽痛等癥狀未知，追問(wèn)家屬患者昏迷前無(wú)發(fā)熱、乏力、咽痛、胸悶、頭痛等癥狀。查體患者咽部未見(jiàn)白色假膜，鼻咽部未見(jiàn)明顯異常?；颊?月8日再次送檢痰液，檢出肺炎克雷伯菌（4+），本次培養(yǎng)未見(jiàn)白喉棒狀桿菌和流感嗜血桿菌?；颊呷朐汉罅⒓唇o予積極治療，包括手術(shù)、呼吸機(jī)輔助通氣、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗血管痙攣、抗炎補(bǔ)液等支持對(duì)癥治療等，但患者蛛網(wǎng)膜下腔出血嚴(yán)重，于6月9日09:40 宣布臨床死亡。

追問(wèn)其家屬流行病學(xué)史，患者近期無(wú)白喉病人接觸史，無(wú)旅行史，白喉疫苗接種史不詳，家屬中未有類似白喉棒狀桿菌感染情況發(fā)生。

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定及藥敏結(jié)果 患者6月4日送檢痰液標(biāo)本培養(yǎng)24 h 在血平板上呈灰白色、圓形突起，單一菌落（圖1），麥康凱及巧克力平板未見(jiàn)相應(yīng)的菌落生長(zhǎng)，巧克力平板可見(jiàn)流感嗜血桿菌。將該血平板上菌落涂片革蘭染色，鏡下可見(jiàn)革蘭陽(yáng)性桿菌（圖2）。挑選單個(gè)菌落經(jīng)VITEK MS 梅里埃質(zhì)譜儀蛋白分析提示99.9%為白喉棒狀桿菌。白喉棒狀桿菌藥敏結(jié)果顯示所有測(cè)試結(jié)果均敏感，見(jiàn)表1?；颊?月8日再次送檢痰標(biāo)本培養(yǎng)檢出肺炎克雷伯桿菌（4+），未出現(xiàn)白喉棒狀桿菌和流感嗜血桿菌菌落。

圖1 血平板菌落形態(tài)

表1 白喉棒狀桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖2 革蘭氏染色細(xì)菌形態(tài)

2.3 宏基因組測(cè)序結(jié)果 見(jiàn)圖3?；颊咛狄核蜋zmNGS 結(jié)果顯示：高置信度指標(biāo)包括人單純皰疹病毒1 型、肺炎克雷伯菌、丙酸棒狀桿菌、白喉棒狀桿菌、溶血隱秘桿菌、46 種口腔/呼吸道定植菌。因?yàn)樗蜋z標(biāo)本為痰液，本身存在大量口腔正常菌群，除了口腔正常菌群外，檢測(cè)結(jié)果中顯示肺炎克雷伯菌和白喉棒狀桿菌存在較高的濃度、序列數(shù)及基因組覆蓋度。同時(shí)檢出耐藥基因ErmX，提示大環(huán)內(nèi)酯類、林可胺類及鏈陽(yáng)霉素類耐藥。

圖3 宏基因組測(cè)序（mNGS）陽(yáng)性病原體分布情況

2.4 16S rDNA 測(cè)序結(jié)果 該菌株經(jīng)過(guò)DNA 提取、16S rDNA 區(qū)段擴(kuò)增、二代測(cè)序及生物信息分析提示：該菌株99.8%物種分布為白喉棒狀桿菌。

2.5 毒力基因結(jié)果 見(jiàn)圖4。采用普通PCR 檢測(cè)toxA 和toxB 毒力基因結(jié)果顯示：該菌株toxA 和toxB 毒力基因均為陰性，陽(yáng)性對(duì)照菌株toxA 和toxB 毒力基因均為陽(yáng)性，結(jié)果提示該例菌株不含白喉棒狀桿菌毒力基因。

圖4 普通PCR 檢測(cè)毒力基因toxA 和toxB 結(jié)果

3 討論

本例患者入院先后送檢兩份痰液標(biāo)本，分別檢出白喉棒狀桿菌（1+）和肺炎克雷伯菌（4+），只在初次分離到白喉棒狀桿菌，出現(xiàn)此種結(jié)果的原因可能為：患者入院后即開始使用頭孢他啶聯(lián)合左氧氟沙星抗感染，而白喉棒狀桿菌藥敏結(jié)果顯示對(duì)絕大多數(shù)抗生素有著高度敏感性；由于患者病情較重入院即做了栓塞術(shù)、引流術(shù)及氣管插管等有創(chuàng)性操作，增加了醫(yī)院內(nèi)感染風(fēng)險(xiǎn)；檢出的肺炎克雷伯菌為耐碳青霉烯類菌株，屬于廣泛耐藥菌株，除外替加環(huán)素和黏菌素均耐藥。初次痰液標(biāo)本中檢出的白喉棒狀桿菌，經(jīng)質(zhì)譜、mNGS 和16S rDNA 測(cè)序等鑒定均符合白喉棒狀桿菌特性，毒力基因檢測(cè)提示不產(chǎn)toxA 和toxB 毒力基因，但患者無(wú)上呼吸道感染癥狀，且查體未見(jiàn)白喉特征性白色假膜，根據(jù)白喉診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，該患者為“無(wú)毒力白喉棒狀桿菌攜帶者”。本例為上海近年來(lái)檢出的首例無(wú)毒力白喉棒狀桿菌攜帶者，文獻(xiàn)報(bào)道[6-8]廣州、浙江和福建2019年先后分別出現(xiàn)了無(wú)毒力白喉棒狀桿菌攜帶者。隨著白喉疫苗的計(jì)劃免疫實(shí)施，全國(guó)范圍內(nèi)的白喉發(fā)病率已經(jīng)得到了極大的控制，雖然本例為無(wú)毒力白喉棒狀桿菌攜帶者，但仍應(yīng)引起重視，結(jié)合此前報(bào)道的三例，有預(yù)防接種不詳者，也有明確預(yù)防接種史者，出現(xiàn)這種人群中偶發(fā)現(xiàn)象到底是免疫接種不完全還是人群免疫力普遍降低造成的，目前尚不能明確。

從發(fā)展中國(guó)家到發(fā)達(dá)國(guó)家，由于全球化使人們能夠從一個(gè)地方流動(dòng)到另一個(gè)地方，白喉仍然是一個(gè)公共衛(wèi)生問(wèn)題[12]。雖然中國(guó)已經(jīng)普遍控制白喉，但是一些發(fā)展中國(guó)家仍有白喉暴發(fā)，2017年印度尼西亞出現(xiàn)了白喉暴發(fā)[13]，菲律賓馬尼拉目前仍有大量白喉病例[14]，尤其在幼兒中存在較高死亡率，提示可能與延遲入院或缺乏白喉抗毒素相關(guān)。一些發(fā)達(dá)國(guó)家也有相關(guān)白喉病例發(fā)生，2016年法國(guó)報(bào)道[15]從2000年開始出現(xiàn)白喉復(fù)燃的情況，主要集中發(fā)生在旅行者和難民，除了疫苗覆蓋率不足還與國(guó)際旅行和日益增加的移民要求息息相關(guān)。

一直以來(lái)認(rèn)為白喉棒狀桿菌主要致病型為產(chǎn)毒菌株，近年來(lái)在包括波蘭在內(nèi)的許多國(guó)家發(fā)現(xiàn)，非產(chǎn)毒性白喉棒狀桿菌也可引起感染，常表現(xiàn)為菌血癥和心內(nèi)膜炎等，死亡率很高[16]。本例患者由于其本身基礎(chǔ)疾病較重可能掩蓋了白喉棒狀桿菌攜帶引起的感染癥狀，也正是由于患者入院接受治療才會(huì)送檢痰液標(biāo)本檢出白喉棒狀桿菌，如果患者長(zhǎng)期處于攜帶狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生免疫功能低下時(shí)極有可能并發(fā)感染，引發(fā)相應(yīng)的疾病。

上海作為國(guó)際貿(mào)易樞紐，存在極高的輸入性病例風(fēng)險(xiǎn)，又有國(guó)內(nèi)復(fù)燃的威脅，所以做好高質(zhì)量的預(yù)防接種覆蓋率和加強(qiáng)臨床實(shí)驗(yàn)室診斷水平顯得至關(guān)重要。尤其在臨床癥狀不典型的情況下，實(shí)驗(yàn)室診斷對(duì)有效管理疑似病例及攜帶患者具有重要臨床意義，可減少白喉的發(fā)病率及死亡率。目前絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)具備白喉棒狀桿菌的快速鑒定能力，近些年質(zhì)譜技術(shù)的迅速發(fā)展更是大力推進(jìn)了微生物的鑒定能力，相比傳統(tǒng)的涂片鏡檢和生化反應(yīng)鑒定，該技術(shù)不僅極大地縮短了鑒定所需時(shí)間，具有更多的細(xì)菌種屬鑒定能力，近年來(lái)更是逐漸應(yīng)用于耐藥機(jī)制研究[17]。白喉是否攜帶毒力也是至關(guān)重要，因此除具備鑒定能力外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該提高檢測(cè)毒力基因的能力，盡可能在短時(shí)間內(nèi)向臨床提供全面的實(shí)驗(yàn)室方面信息，以便臨床第一時(shí)間作出應(yīng)對(duì)措施，同時(shí)聯(lián)合感控部門共同建立規(guī)范的應(yīng)對(duì)制度。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)散發(fā)非產(chǎn)毒白喉棒狀桿菌無(wú)癥狀攜帶者，目前尚不能排除其感染致病的可能性，所以對(duì)這類病例報(bào)道很重要，不僅可以加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室診斷水平，同時(shí)推動(dòng)相關(guān)發(fā)病機(jī)制的研究，為白喉的感染控制提供更多的臨床數(shù)據(jù)。