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胃癌患者血清miR-181b和PDCD4水平表達與幽門螺桿菌感染的關(guān)系

2021-08-10 06:28饒向東劉振宇湯紅亮項夢琦謝瑞霞
關(guān)鍵詞:陰性受試者胃癌

饒向東,劉振宇,湯紅亮,張 慧,白 雪,項夢琦,謝瑞霞,徐 龍

(1.湖北省孝昌縣第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科,湖北孝感 432900;2.深圳大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科,深圳大學(xué)臨床科學(xué)研究院,深圳大學(xué)國際腫瘤中心,廣東深圳 518055)

胃癌是我國常見的起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤,胃癌可發(fā)病于胃竇部、胃大、小彎等處,早期胃癌表現(xiàn)不明顯,易錯過最佳治療期,晚期胃癌患者常有腹痛、貧血、消瘦、嘔血等臨床表現(xiàn),生存率較低,對患者的生活質(zhì)量及生命安全造成較大影響[1]。胃癌病情發(fā)展復(fù)雜,與遺傳因素、個體因素、環(huán)境因素等多種因素均密切相關(guān)[2],幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)是一種微厭氧的螺旋形病菌,是胃癌、胃炎等消化系統(tǒng)疾病的主要感染菌,患者感染Hp 后,Hp相關(guān)的細胞毒素、酶類、細胞因子等均參與機體的不良反應(yīng),對胃黏膜病變、消化道潰瘍、胃癌、胃炎等疾病的發(fā)生產(chǎn)生不利影響[3-4]。微小RNA是近年來發(fā)現(xiàn)的參與細胞增殖、腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移等多種生理活動的非編碼單鏈RNA,具有促進或抑制腫瘤發(fā)生等作用,miR-181 家族在人體細胞中廣泛存在,miR-181b 是其中之一,與多種腫瘤疾病密切相關(guān)[5]。程序性細胞死亡因子4(programmed cell death factor 4,PDCD4)是近年來發(fā)現(xiàn)的抑癌基因,通過抑制細胞腫瘤性轉(zhuǎn)化發(fā)揮腫瘤抑制作用,在胃癌組織中呈現(xiàn)低表達,與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。本研究通過測定胃癌患者血清中miR-181b,PDCD4 表達情況,分析二者與胃癌患者Hp 感染情況之間的關(guān)系,為臨床診治胃癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2017年12月~2019年12月湖北省孝昌縣第一人民醫(yī)院收治的胃癌患者82例為胃癌組,其中男性42 例,女性40 例,年齡42~79 歲,平均年齡56.71±7.39 歲。同期選取本院健康體檢者91 例為對照組,其中男性46 例,女性45 例,年齡40~81 歲,平均年齡58.38±8.16 歲,兩組研究對象年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。納入標(biāo)準(zhǔn):①診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)》[7];②首次確診為胃癌;③未進行生物治療、放療及化療等。排除標(biāo)準(zhǔn):①伴有其他部位惡性腫瘤患者;②伴有嚴(yán)重心、肺、肝功能不全者;③伴有嚴(yán)重血液疾病及免疫系統(tǒng)疾病等;④近6 個月服用抗生素、抗炎、胃黏膜保護類藥物等。本研究經(jīng)醫(yī)院道德倫理委員會批準(zhǔn)通過,所有樣品采集均取得患者及家屬知情同意并簽字,符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.2 儀器與試劑 RNA 提取試劑盒購于美國Invitrogen 公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 購于日本TAKARA 公司;miScript SYBR?Green qPCR Kit 購于德國QIAGEN 公司;引物,由上海生工生物工程有限公司合成;實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀、全自動生化分析儀購于美國Bio-Rad 公司;13C 呼氣試驗紅外光譜儀購于安徽養(yǎng)和醫(yī)療器械設(shè)備有限公司;光學(xué)顯微鏡購于上海兆儀光電科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Hp 感染檢測:采用13C 呼氣試驗[8]測定對照組及胃癌組受試者的Hp 感染情況,受試者空腹服用13C 尿素膠囊后30 min 通過紅外光譜儀進行呼氣,呼出氣中13C 原子峰大于基線5% 記為Hp 感染陽性。

1.3.2 Hp 感染密度檢測:參考文獻[9],采集胃癌組患者距離幽門2.5 cm 處的胃黏膜組織適量,光學(xué)顯微鏡中進行病理診斷,在油鏡下分析Hp感染密度,Hp 輕度:樣本中Hp 小于1/3;Hp 中度:樣本中Hp 超過1/3 但小于2/3;Hp 重度:樣本中Hp 成堆存在。對照組不進行鏡檢。

1.3.3 血清標(biāo)本采集:采集對照組及胃癌組受試者空腹靜脈血5~6 ml,室溫靜置20 min,4℃下3 000×g 離心10 min,采集血清至RNA 酶離心管中,-80℃冰箱保存?zhèn)溆?,用于后續(xù)RNA的提取。

1.3.4 qRT-PCR 法測定受試者血清中miR-181b,PDCD4 的表達水平:利用RNA 提取試劑盒(Invitrogen 公司)提取血清總RNA,經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,采用實時熒光定量PCR 法(qRT-PCR)對miR-181b,PDCD4 進行擴增。qRT-PCR 反應(yīng)體系共20μl:miScript SYBR?Green Mix 10 μl,cDNA(50ng/μl)2μl,上下游引物(10μmol/L)各1μl,ddH2O 6.0μl。反應(yīng)條件:95 ℃90s;95 ℃30s;62 ℃30s;72 ℃15s;共40 個循環(huán)。miR-181b,PDCD4 及內(nèi)參U6,GAPDH 的引物序列見表1。采用2-??Ct法對血清miR-181b,PDCD4 相對表達水平進行分析。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用軟件SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)對計量資料進行表述,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,組間比較采用SNK-q檢驗;計數(shù)資料用n進行描述,行χ2檢驗;Spearman 法分析miR-181b,PDCD4 與胃癌Hp 感染的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 Hp 感染檢測 對照組中79 例為Hp 感染陰性,12 例為Hp 感染陽性,Hp 感染陽性率為13.19%;胃癌組19 例為Hp 感染陰性,63 例為Hp 感染陽性,Hp 感染陽性率為76.83%;與對照組相比,胃癌組Hp 感染陽性率顯著升高, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=68.571,P<0.05)。

2.2 對照組與胃癌組血清中miR-181b,PDCD4 表達水平比較 見表2。與對照組相比,胃癌組Hp陰性、Hp 陽性患者血清中miR-181b 表達水平均顯著升高(t=13.779,8.158,均P<0.05),PDCD4 表達水平均顯著降低(t=8.432,19.087,均P<0.05),且胃癌組及對照組Hp 陽性患者血清中miR-181b 表達水平高于Hp 陰性患者(t=3.469,4.163,均P<0.05),PDCD4 表達水平低于Hp 陰性患者(t=8.878,16.470,均P<0.05),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 兩組受試者血清中miR-181b,PDCD4 表達水平比較(±s)

表2 兩組受試者血清中miR-181b,PDCD4 表達水平比較(±s)

項 目對照組胃癌組tP Hp 陰性miR-181b0.98±0.191.67±0.2213.7790.000 PDCD41.06±0.180.69±0.138.4320.000 Hp 陽性miR-181b1.19±0.232.28±0.458.1580.000 PDCD40.76±0.110.34±0.0619.0870.000

2.3 不同Hp 感染密度與血清中miR-181b,PDCD4 表達水平比較 見表3。隨著胃癌患者Hp感染密度的增加,Hp 陽性患者血清中miR-181b 表達水平呈依次升高趨勢(t=5.476,7.479,2.227,均P<0.05),PDCD4 表達水平均呈依次降低趨勢(t=10.216,14.014,9.199,均P<0.05)。

表3 不同Hp 感染程度的胃癌患者血清中miR-181b,PDCD4 表達水平比較(±s)

表3 不同Hp 感染程度的胃癌患者血清中miR-181b,PDCD4 表達水平比較(±s)

注:中度組與輕度組相比,miR-181b/U6:t=5.476,P=0.000,PDCD4/GAPDH:t=10.216,P=0.000;重度組與中度組相比:miR-181b/U6:t=2.227,P=0.034,PDCD4/GAPDH:t=9.199,P=0.000;重度組與輕度組相比:miR-181b/U6:t=7.479,P=0.000,PDCD4/GAPDH:t=14.014,P=0.000。

項 目Hp 密度F P輕度(n=32)中度(n=19)重度(n=12)miR-181b/U61.87±0.372.54±0.502.98±0.598.8750.000 PDCD4/GAPDH0.48±0.090.25±0.050.11±0.0239.6440.000

2.4 胃癌患者Hp 感染與血清miR-181b,PDCD4表達水平相關(guān)性分析 Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示血清中miR-181b 水平與胃癌患者Hp 感染呈正相關(guān)性,與Hp 陽性相關(guān)系數(shù)為0.659,與Hp 陰性相關(guān)系數(shù)為0.685(P<0.001),血清中PDCD4 水平與胃癌患者Hp 感染呈負相關(guān)性,與Hp 陽性相關(guān)系數(shù)為-0.611,與Hp 陰性相關(guān)系數(shù)為-0.702(P<0.001)。

3 討論

胃癌是臨床常見的惡性腫瘤之一,隨著現(xiàn)代飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的改變以及環(huán)境污染加重、農(nóng)藥、化肥等藥品的大量使用,造成胃癌發(fā)病率逐年升高,胃癌患者常會有上腹疼痛、進行性吞咽困難、嘔血、黑便等不良表現(xiàn),對患者的身體、心理健康及生活質(zhì)量造成較大的影響[10]。引起胃癌發(fā)生的原因多樣,Hp 感染是引發(fā)胃癌的重要危險因素,資料顯示Hp具有調(diào)控細胞生長和分化的作用,進而引發(fā)機體的炎癥反應(yīng),加劇胃黏膜損傷,從而引起癌變[11]。本研究結(jié)果顯示,胃癌組Hp 感染陽性率顯著高于健康體檢者,提示胃癌患者中具有較高的Hp 感染陽性率,表明Hp 感染與胃癌發(fā)生密切相關(guān),Hp 常存在于胃竇部、胃小凹等胃癌常發(fā)部位,這些部位長期受到Hp 的感染,引發(fā)癌變的幾率會大大增加[12]。

miRNA 為一類具有多種生物學(xué)功能的進化保守的短序列小RNA,主要通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達作為抑癌基因或原癌基因參與機體腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,諸多研究表明miRNA 異常表達與胃癌的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切[13],資料顯示miR-181 家族在胃癌、肝癌、肺癌等腫瘤的形成發(fā)展中起到重要作用,miR-181b 是其中一員,miR-181b 在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達,高表達的miR-181b 對于胃癌患者的生存具有不利影響[14]。本研究結(jié)果顯示,胃癌組Hp陰性、Hp 陽性患者血清中miR-181b 表達水平均顯著高于對照組,且胃癌組及對照組Hp 陽性患者血清中miR-181b 表達水平高于Hp 陰性患者,提示miR-181b 可能參與了胃癌疾病的進展。

PDCD4 是近年來發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因,與胃癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),其在胃癌中的具體機制尚不清晰[15]。研究發(fā)現(xiàn)PDCD4 在胃癌患者血清中呈現(xiàn)低表達,且與患者的不良飲食習(xí)慣呈現(xiàn)相關(guān)性[16]。LI 等[17]人研究發(fā)現(xiàn)在高表達的miR-183 通過抑制PDCD4 的表達來促進胃癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移等。本研究結(jié)果顯示,胃癌組Hp 陰性、Hp 陽性患者血清中PDCD4 表達水平均顯著低于對照組,且胃癌組及對照組Hp 陽性患者血清中PDCD4 表達水平低于Hp 陰性患者,與miR-181b 表達水平呈現(xiàn)相反趨勢,提示PDCD4低表達可能對于胃癌疾病具有不利影響,提示miR-181b 與PDCD4 具有一定的負向調(diào)控關(guān)系,表明miR-181b 可能通過靶向PDCD4 來發(fā)揮促癌作用;隨著胃癌患者Hp 感染密度的增加,Hp 陽性患者血清中miR-181b 表達水平呈依次升高趨勢,PDCD4表達水平均呈依次降低趨勢,Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示血清中miR-181b 與胃癌患者Hp 感染呈正相關(guān)性,血清中PDCD4 與胃癌患者Hp 感染呈負相關(guān)性,表明Hp 感染可能具有一定影響miR-181b,PDCD4 表達水平的作用,可能共同參與了胃癌的發(fā)生。

胃癌的發(fā)生與多種因素相關(guān),其發(fā)生機制復(fù)雜。本研究通過測定胃癌患者的Hp 感染情況及血清中miR-181b,PDCD4 的表達水平,發(fā)現(xiàn)Hp 感染程度的加深與miR-181b 表達水平的升高及PDCD4 表達水平的降低密切相關(guān),三者的異常表達均參與了胃癌的發(fā)生及發(fā)展,但其中的潛在機制尚不清晰,仍需進一步研究。

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