馬 超 張 韜 林潤臺(tái) 周 煉 翟海昕 朱智慧 趙繼志

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，它具有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高的特點(diǎn)。在我國每年約有4.56萬新發(fā)口腔鱗狀細(xì)胞癌病例，其中16%～55%的患者伴有頸部淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處部位轉(zhuǎn)移[1，2]。研究表明，OSCC患者如伴有同側(cè)或?qū)?cè)單個(gè)頸淋巴轉(zhuǎn)移，患者術(shù)后生存率較未轉(zhuǎn)移患者降低50%[3]，是導(dǎo)致患者預(yù)后差的主要原因。因此探究癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程中的新機(jī)理，對OSCC轉(zhuǎn)移性病例的有效治療具有重要的意義。

CCL5（C-C chemokine ligand 5）是一種重要的趨化因子，它能夠通過招募腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophages，TAMs）促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。TAMs是腫瘤微環(huán)境中最豐富的炎癥細(xì)胞之一，其分泌的趨化因子（例如CCL5）是介導(dǎo)TAMs和癌細(xì)胞交聯(lián)的重要載體。研究表明，來源于巨噬細(xì)胞的CCL5可以促進(jìn)前列腺癌干細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[5]。因此，通過抑制CCL5阻斷TAMs與癌細(xì)胞的交聯(lián)，可能成為惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點(diǎn)。本研究旨在探究TAMs來源的CCL5在OSCC轉(zhuǎn)移中的重要作用機(jī)制，以期為OSCC轉(zhuǎn)移的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

資料和方法

1.臨床資料：選取北京協(xié)和醫(yī)院口腔頜面外科2015年4月至2019年12月收集資料完整的OSCC患者81例，所有患者術(shù)前均未接受化療或放療，術(shù)中留取腫瘤原發(fā)灶和癌旁組織（對照）樣本。本研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有病例均明確診斷，所有參與者均知情同意。

2.免疫組化方法及判定標(biāo)準(zhǔn)：免疫組織化學(xué)檢測按照文獻(xiàn)所述的方法進(jìn)行[6]，一抗分別為CCL5抗體（1∶100 dilution，ab9679，Abcam），CD163抗體（1∶100 dilution，ab51037，Abcam）。免疫組化結(jié)果由兩位病理學(xué)家采用免疫應(yīng)答評分法（IRS）評估。

3.細(xì)胞培養(yǎng)：本研究使用兩株OSCC細(xì)胞系（CAL27和SCC-9）以及人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株THP-1（ATCC，Rockville，MD，USA）。THP-1細(xì)胞經(jīng)320nM PMA以及20ng/ml IL-4（PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA）處理20h后，誘導(dǎo)分化為TAMs。OSCC細(xì)胞株在RPMI培養(yǎng)基中添加10%血清白蛋白和1%青霉素/鏈霉素。細(xì)胞使用PBS、20μM ERK抑制劑（pd98059）、10μM P38抑制劑（sb203580）、CCR5單克隆抗體（Mab17959，Abnova）以及CCL5 siRNA（sc-44066，Santa Cruz）在無血清培養(yǎng)基中處理1h，檢測細(xì)胞侵襲和蛋白表達(dá)。

4.免疫印跡：免疫印記檢測按照文獻(xiàn)所述的方法進(jìn)行[6]。一抗使用Vimentin（1∶500，10366-1-ap，Proteintech）和E-cadherin（1∶500，ab40772，Abcam）抗體。

5.免疫熒光：按照文獻(xiàn)所述[6]采用免疫熒光法檢測口腔鱗癌組織中CCL5和TAMs標(biāo)志物CD163的共定位。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0（Chicago，IL，USA）和Graphpad Prism（La Jolla，CA，USA）統(tǒng)計(jì)軟件。CCL5和CD163表達(dá)相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

結(jié)果顯示，CCL5和CD163在癌旁組織中均無表達(dá)，而在癌組織中高表達(dá)（圖1A-F）。CCL5在轉(zhuǎn)移腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于無轉(zhuǎn)移腫瘤組織（IRS評分，4～9；P＜0.001），與CD163的表達(dá)具有相似趨勢（P＜0.001，圖1A-F）。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CCL5和CD163在39例患者中高表達(dá)，14例中低表達(dá)，兩者表達(dá)顯著相關(guān)（圖1G），提示CCL5參與了TAMs誘導(dǎo)的口腔鱗癌轉(zhuǎn)移。

圖1 CCL5和CD163在OSCC組織中表達(dá)升高

筆者首次發(fā)現(xiàn)OSCC腫瘤組織中CCL5與CD163存在共定位（圖2A-C），且在轉(zhuǎn)移腫瘤組織中檢測到顯著增強(qiáng)的共定位信號（圖2D-F），證實(shí)OSCC腫瘤微環(huán)境中的CCL5主要來源于TAMs而非腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CAL27和SCC-9細(xì)胞與TAMs共培養(yǎng)后比未經(jīng)TAMs共培養(yǎng)的細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力（圖3），在培養(yǎng)基中加入CCR5單抗（10g/ml）以及CCL5 siRNA能夠顯著降低TAMs誘導(dǎo)的OSCC細(xì)胞侵襲。這些結(jié)果表明TAMs來源的CCL5推動(dòng)了OSCC細(xì)胞侵襲。

圖2 CCL5和CD163在OSCC組織中共定位增加

圖3 抑制CCL5降低了TAMs誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲

筆者發(fā)現(xiàn)，CAL27和SCC-9細(xì)胞與TAMs共培養(yǎng)可降低上皮標(biāo)記物E-cadherin的水平，同時(shí)提高間充質(zhì)標(biāo)記物Vimentin的水平（P＜0.05）（圖4）。ERK1/2和P38抑制劑顯著降低E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)增加了Vimentin的水平。結(jié)果表明TAMs來源的CCL5通過激活P38/ERK1/2通路，調(diào)節(jié)EMT轉(zhuǎn)化，推動(dòng)了TAMs介導(dǎo)的OSCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。

圖4 P38/ERK1/2通路參與了OSCC細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化

討 論

CCL5是TAMs與腫瘤細(xì)胞之間惡性循環(huán)的重要交聯(lián)，已被證實(shí)在胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌以及黑色素瘤的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展中有重要的推動(dòng)作用[7]。筆者通過臨床樣本檢測，首次發(fā)現(xiàn)OSCC組織中TAMs與CCL5存在共定位，證實(shí)OSCC腫瘤微環(huán)境中的CCL5主要來源于TAMs而非腫瘤細(xì)胞。同時(shí)發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC組織中CCL5及CD163的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織和癌旁組織，且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)。該結(jié)果與affymetrix微陣列數(shù)據(jù)集分析結(jié)果一致（GSE2280，GSE3524）[8，9]，證實(shí)TAMs來源的CCL5與OSCC的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在OSCC腫瘤治療方面具有潛在應(yīng)用前景。

筆者發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞能夠誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞侵襲顯著增加。給予CCL5 siRNA以及CCR5阻斷抗體能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲，這些結(jié)果再次佐證了TAMs來源的CCL5在OSCC細(xì)胞侵襲中起重要作用。口腔鱗狀細(xì)胞癌是一種上皮來源惡性腫瘤，已有研究顯示，TAMs來源的CCL5通過刺激上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）從而推動(dòng)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[5]。筆者發(fā)現(xiàn)TAMs來源的CCL5能夠下調(diào)OSCC細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)同時(shí)上調(diào)波形蛋白Vimentin的表達(dá)，證實(shí)CCL5推動(dòng)了EMT轉(zhuǎn)化途徑。研究發(fā)現(xiàn)，P38、MAPK和ERK通路的激活參與了口腔鱗狀細(xì)胞癌EMT轉(zhuǎn)化途徑[10]。筆者證實(shí)p-ERK1/2和p-P38抑制劑明顯阻斷CAL27和SCC-9細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)化。這些數(shù)據(jù)表明CCL5通過ERK1/2/p38信號通路，調(diào)節(jié)EMT轉(zhuǎn)化，推動(dòng)了OSCC細(xì)胞的侵襲。