付世華 ,周 驥 ,葉曉芳 ,楊丹丹 ,楊絲絮 (.蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生研究所,甘肅 蘭州 730000；.上海市氣象局上海市氣象與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 00030)

哮喘是由多種細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的以氣道慢性炎癥為特征的異質(zhì)性疾病[1-2].PM2.5已被科學(xué)證實(shí)與哮喘急性加重以及反復(fù)發(fā)作密切相關(guān)[3-4].近年來免疫學(xué)研究認(rèn)為,Th17輔助細(xì)胞(Th17)及調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(Treg)與PM2.5發(fā)揮毒效應(yīng)有著密切聯(lián)系[5],在哮喘發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6-7].Th17細(xì)胞主要受轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤核受體 γt(RORγt)的調(diào)節(jié),能夠高表達(dá)分泌白介素 17(IL-17),造成炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及組織損傷[8-10].而由叉頭轉(zhuǎn)錄因子 p3(Foxp3)介導(dǎo)分化的Treg細(xì)胞是和Th17細(xì)胞具有相反作用的另一類T細(xì)胞亞群,它在控制免疫炎癥方面起著重要的作用,兩者的失衡極化狀態(tài)被認(rèn)為是引發(fā)炎癥性疾病如哮喘的重要原因[11-12].有實(shí)驗(yàn)證實(shí)高濃度的顆粒物暴露可誘導(dǎo)RORγt的產(chǎn)生,下調(diào)Foxp3的表達(dá),通過影響RORγt /Foxp3通路途徑來使Th17/Treg細(xì)胞極化,介導(dǎo) PM2.5的機(jī)體損傷過程[13-15].

除PM2.5的影響外,低溫刺激作為引起哮喘急性發(fā)作的常見危險(xiǎn)因素也得到了廣泛的研究[16-18].越來越多證據(jù)表明低溫刺激和細(xì)顆粒物聯(lián)合暴露對(duì)呼吸系統(tǒng)的影響存在一定聯(lián)系.流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),秋冬季節(jié)的溫度驟降對(duì)顆粒物致哮喘急診就診率增加有顯著影響,且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[19].國(guó)內(nèi)外研究也指出,PM2.5和環(huán)境溫度與哮喘發(fā)病率有明顯關(guān)聯(lián),認(rèn)為低溫和PM2.5可能產(chǎn)生協(xié)同作用引起不利的呼吸系統(tǒng)健康影響[20-21].此外,一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究也表明,持續(xù)的低溫刺激可以促進(jìn)PM2.5引起的炎癥反應(yīng),顯著增加肺內(nèi)多種炎癥因子的濃度[22].由此可見,低溫刺激可能會(huì)增強(qiáng)PM2.5對(duì)炎癥性疾病的毒性作用,但目前關(guān)于低溫刺激和PM2.5對(duì)哮喘氣道炎癥影響僅限于流行病學(xué)研究.本文利用低溫刺激與PM2.5對(duì)哮喘小鼠進(jìn)行聯(lián)合暴露實(shí)驗(yàn),觀察聯(lián)合暴露對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥的加重情況,驗(yàn)證低溫刺激和細(xì)顆粒物之間存在的交互作用,并初步探索 Th17/Treg 信號(hào)通路與交互作用致哮喘加劇的潛在聯(lián)系,以期為哮喘治療早期預(yù)測(cè)應(yīng)答提供新思路.

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型建立

8周齡雄性無特定病原體的BALB/c小鼠35只,體重 20～25g,由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(合格證號(hào): 2010002609112),適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后建立小鼠哮喘模型.詳細(xì)建模方法見前期研究[20].模型成功標(biāo)準(zhǔn)具體如下: 末次激發(fā) 24h后(第 28d),以小鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、腹肌痙攣等陽性反應(yīng)作為一般觀察標(biāo)準(zhǔn); 隨機(jī)抽取3只小鼠麻醉處死,摘取左肺于4%多聚甲醛溶液中固定用于病理染色,以光鏡下觀察到彌漫性細(xì)小支氣管和血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或支氣管上皮杯狀細(xì)胞增生、平滑肌增厚等病理改變作為組織病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[23].

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及暴露

哮喘模型建立成功后,將32只哮喘小鼠隨機(jī)分為 4組(每組 8只),分別是對(duì)照組、低溫組、PM2.5組和聯(lián)合暴露組.將小鼠飼養(yǎng)于氣象環(huán)境模擬箱中,使用“上海市氣象環(huán)境動(dòng)物暴露系統(tǒng)”(專利號(hào)201510453600.8)[24]對(duì)哮喘小鼠進(jìn)行PM2.5暴露染毒實(shí)驗(yàn).具體暴露條件如下: 對(duì)照組和 PM2.5組的環(huán)境溫度為21～23℃,低溫組和聯(lián)合暴露組的環(huán)境溫度為2～4℃,PM2.5組和聯(lián)合暴露組中有 PM2.5染毒步驟,基于本文前期研究選擇暴露濃度為 400μg/m3[22].在此濃度下,PM2.5會(huì)對(duì)哮喘小鼠產(chǎn)生不利影響.暴露共持續(xù)4周,平均每天8h.所有實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)上海市氣象局動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn).

1.3 標(biāo)本制備

支氣管肺泡灌洗液(BALF)收集于末次暴露48h后,麻醉處死小鼠.仰臥位固定,無菌條件下分離氣管,結(jié)扎左主支氣管后,剪開右主支氣管插入氣管導(dǎo)管并固定,PBS緩沖液灌洗3次,1mL/次,收集的BALF于4℃,1500g離心10min,PBS重懸細(xì)胞沉淀并涂片,進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù).

1.4 組織病理學(xué)檢查

取左肺組織用 4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋,4μm 切片,二甲苯脫蠟,梯度酒精水化,蒸餾水沖洗10min,蘇木素-伊紅(HE)染色后,酒精脫水、透明、封片.光鏡下觀察炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肺組織結(jié)構(gòu)的改變.

1.5 炎性因子及氧化損傷指標(biāo)

按照試劑盒(Minneapolis,USA)說明書,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)BALF中白介素(IL)4、IL-6和 IL-13濃度.嚴(yán)格按照相應(yīng)的試劑盒(Sigma,USA)說明書操作,測(cè)定BALF中氧化損傷指標(biāo):過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平.

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

Trizol法提取細(xì)胞總 RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成c RNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè).具體基因引物序列交由上海鈺森生物公司設(shè)計(jì)合成.PCR反應(yīng)體系為 20μL,反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 30s,95℃變性5s,60℃退火 34s,72℃延伸 30s,共 40個(gè)周期.以β-actin 為內(nèi)參,采用 2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)水平.每個(gè)樣本有3個(gè)重復(fù)對(duì)照.

1.7 Th17/Treg細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

取小塊肺組織(約0.5cm2),用PBS沖洗離心以去除紅細(xì)胞,采用研磨法制備單細(xì)胞懸液并稀釋,流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6plus)測(cè)定組織中 Th17、Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)變化.Flow Jo 10用于進(jìn)一步的圖像處理和數(shù)據(jù)分析.

1.8 數(shù)據(jù)分析

用Origin lab 2019繪圖,SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.采用單因素方差分析不同處理組內(nèi)各指標(biāo)水平差異,若各組間方差齊,則采用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較,對(duì)不服從正態(tài)分布的多組間中位數(shù)比較采用 Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),通過析因設(shè)計(jì)方差分析測(cè)定低溫刺激和PM2.5暴露的交互作用.數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P值小于0.05被認(rèn)為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果分析

2.1 肺組織病理檢查

HE染色顯示,4組小鼠均有不同程度的肺部病理改變,即彌漫性細(xì)小支氣管和血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),但組間差異不太明顯.相比其他3組,聯(lián)合暴露組小鼠支氣管、肺泡內(nèi)及血管周圍可見較顯著炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象,見圖1.

圖1 HE染色顯示支氣管內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(200×)Fig.1 HE staining showed infiltration of inflammatory cells in bronchus(200×)

2.2 細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

圖2表明,聯(lián)合暴露組中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),并且與低溫組相比,聯(lián)合暴露組小鼠的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量顯著較高(P<0.05),但低溫刺激和 PM2.5暴露對(duì)其影響的交互作用不顯著.

圖2 分類炎癥細(xì)胞水平Fig.2 Classified inflammatory cell levels

2.3 炎癥因子

圖3顯示,聯(lián)合暴露組中IL-4、IL-6、IL-13、IL-17和TGF-β均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),同時(shí)也顯著高于低溫組和 PM2.5組(P<0.05).其中低溫組和PM2.5組中IL-6、IL-17和TGF-β的相對(duì)水平較高,均顯著高于對(duì)照組(P<0.05).方差分析結(jié)果顯示,低溫和PM2.5之間的交互作用對(duì)IL-4、IL-13及IL-17的相對(duì)水平有影響(P<0.05),提示在低溫刺激下,PM2.5對(duì)哮喘小鼠炎癥因子的影響更大,可能會(huì)引起更為明顯的炎癥反應(yīng).

圖3 炎癥因子的相對(duì)水平Fig.3 Relative levels of inflammatory factors

2.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)

如圖4所示,低溫組和PM2.5組CAT顯著低于對(duì)照組(P<0.05),而GSH、SOD和MDA與對(duì)照組間差異不顯著.在聯(lián)合暴露組中上述 4個(gè)指標(biāo)均與對(duì)照組有顯著性差異,CAT、GSH和SOD明顯低于對(duì)照組,MDA 明顯高于對(duì)照組(P<0.05),提示聯(lián)合暴露組小鼠氧化損傷較對(duì)照組明顯.并且,相比 PM2.5組,聯(lián)合暴露組中CAT、SOD明顯較低(P<0.05),MDA明顯較高(P<0.05).方差分析結(jié)果顯示,低溫和 PM2.5之間的交互作用對(duì)MDA的相對(duì)水平有影響(P<0.05),表明低溫刺激和 PM2.5的共同暴露可能會(huì)引起更嚴(yán)重的組織氧化損傷.

圖4 CAT、GSH、SOD和MDA相對(duì)水平Fig.4 Relative levels of CAT, GSH, SOD and MDA

2.5 Th17、Treg細(xì)胞比例及其轉(zhuǎn)錄因子

RORγt和Foxp3是Th17和Treg細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄因子,可代表性反映Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞的平衡狀況.圖5～圖6顯示,聯(lián)合暴露組哮喘小鼠肺組織內(nèi)Th17細(xì)胞比例最高,Treg細(xì)胞比例最低,并且轉(zhuǎn)錄因子 RORγt mRNA表達(dá)量顯著高于相應(yīng)單純暴露的低溫組和 PM2.5組(P<0.05).方差分析結(jié)果顯示,低溫和PM2.5之間的交互作用對(duì)RORγt的mRNA相對(duì)水平有影響(P<0.05).在 Foxp3的結(jié)果中,PM2.5組和聯(lián)合暴露組明顯低于對(duì)照組(P<0.05),盡管方差分析顯示無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.上述結(jié)果提示較低溫度刺激可能會(huì)增加PM2.5暴露對(duì)RORγt表達(dá)量的影響,并通過推動(dòng)PM2.5暴露引起的Th17細(xì)胞比例增加對(duì)哮喘產(chǎn)生影響.

圖5 RORγt、Foxp3的mRNA相對(duì)水平Fig.5 Relative mRNA levels of RORγt and Foxp3

圖6 Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例情況Fig.6 Proportion of Th17 cells and Treg cells

3 討論

低溫刺激和大氣顆粒物 PM2.5都是哮喘的危險(xiǎn)因素[3,16].本文通過對(duì)哮喘模型小鼠進(jìn)行低溫刺激和PM2.5聯(lián)合暴露實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示低溫聯(lián)合 PM2.5暴露可以上調(diào)炎癥細(xì)胞因子和氧化損傷水平,兩者在加劇肺部炎癥及氧化損傷方面具有交互作用.大量流行病學(xué)研究表明,低溫時(shí) PM2.5的歸因危險(xiǎn)度增加,且 PM2.5與氣溫對(duì)呼吸系統(tǒng)死亡率的影響有交互作用[25-28].研究認(rèn)為這種作用可能與低溫刺激和 PM2.5聯(lián)合暴露促進(jìn)呼吸系統(tǒng)炎癥因子等指標(biāo)的增加有關(guān)[29-31].與上述的研究結(jié)論類似,本研究結(jié)果顯示低溫聯(lián)合PM2.5暴露可促進(jìn)肺部炎癥反應(yīng)和氧化損傷,加重哮喘模型小鼠氣道炎癥及肺組織病變,提示低溫刺激對(duì)PM2.5介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有重要貢獻(xiàn).

Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞是一對(duì)功能上相互抑制的免疫細(xì)胞群,與機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)[6].在免疫細(xì)胞分化過程中,Treg細(xì)胞可經(jīng)由TGF-β誘導(dǎo)產(chǎn)生,然而當(dāng)IL-6和TGF-β共同存在時(shí),Treg細(xì)胞分化路徑因受到抑制而分化成為Th17細(xì)胞[32].有研究發(fā)現(xiàn),在大氣顆粒物引起機(jī)體毒性損傷的過程中,肺組織內(nèi) Th17細(xì)胞表型有明顯增加,存在 Th17/Treg細(xì)胞失衡情況[33],并且Th17細(xì)胞極化使IL-17大量分泌,又進(jìn)一步加劇了 PM2.5導(dǎo)致的炎癥反應(yīng).這與本研究的結(jié)果一致,即聯(lián)合暴露對(duì) IL-17、RORγt和Foxp3的mRNA表達(dá)量影響顯著,且低溫和PM2.5對(duì)RORγt改變存在交互效應(yīng),這表明低溫刺激在 PM2.5誘導(dǎo)推動(dòng) Th17/Treg比例失調(diào)的過程中起到了重要作用.結(jié)合之前IL-6和TGF-β在聯(lián)合暴露組中高表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測(cè)持續(xù)的低溫刺激可以高效地促進(jìn)激活 RORγt /Foxp3途徑,推動(dòng) PM2.5介導(dǎo)的Th17/Treg細(xì)胞失衡,在此過程中機(jī)體分泌的炎癥細(xì)胞因子IL-6與內(nèi)源性TGF-β共同發(fā)揮作用,在一定程度上抑制了 Treg細(xì)胞的增殖分化,更加劇了肺部 Th17/Treg免疫失衡狀態(tài),從而形成以 Th17細(xì)胞極化為主導(dǎo)的促炎趨勢(shì),進(jìn)而加劇了哮喘氣道炎癥.然而目前低溫聯(lián)合 PM2.5調(diào)控 Th17細(xì)胞分化通路的具體機(jī)制尚不明確,仍有待進(jìn)一步挖掘.

4 結(jié)論

4.1 低溫聯(lián)合PM2.5暴露后,可顯著影響小鼠BALF中炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)的相對(duì)水平,在一定程度上加重了哮喘小鼠的肺部炎癥和氧化損傷.

4.2 聯(lián)合暴露激活了RORγt /Foxp3調(diào)控通路,進(jìn)而上調(diào)Th17細(xì)胞比例,增加IL-17分泌,從而加重哮喘小鼠的氣道炎癥.