楊福霞,馬曉彤,韓舜愈

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州,730070)

莧菜紅[1-(4′-磺酸基-1′-萘偶氮)-2-萘酚-3,6-二磺酸三鈉鹽]是一種水溶性偶氮合成染料,與天然染料相比,其具有對光、氧和pH穩(wěn)定性高，且具有顏色均勻、微生物污染低、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點,已作為食品著色劑在飲料和食品中廣泛使用,以增加產(chǎn)品外觀和吸引力[1-2]。然而,由于其具有高遺傳毒性、細胞毒性、抑制細胞生長的作用,過量食用莧菜紅已成為一個有損人體健康的問題[3-5]。出于食品安全考慮,糧農(nóng)聯(lián)合組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑專家委員會建議莧菜紅的每日允許攝入量應(yīng)在0～0.5 mg/kg[6-7],我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》(GB 2760—2011)嚴格規(guī)定食品中莧菜紅最大使用限量為0.05 g/kg。但是,仍有一些非法商業(yè)食品生產(chǎn)商在其產(chǎn)品中添加過量的莧菜紅。因此,嚴格控制食品中莧菜紅的含量對人類健康和食品安全至關(guān)重要。

迄今為止,已報道了很多莧菜紅的檢測方法,常用的方法有毛細管電泳法[8-9]、電化學(xué)方法[10-11]、分光光度法[12-13]、高效液相色譜法[14-15],薄層色譜法[16]。其中,分光光度法、毛細管電泳法的靈敏度較低、線性范圍較窄、檢出限較高；高效液相色譜法雖靈敏度高,對含復(fù)雜組分的樣品分析優(yōu)勢較明顯,但樣品的前處理時間較長,并且操作者需要具備一定的技術(shù)積累,同時所需的儀器價格比較昂貴。因此,發(fā)展快速、靈敏、簡單、高效的檢測莧菜紅的方法具有極其重要的意義。

近年來,熒光納米顆粒由于發(fā)光顏色可調(diào)、激發(fā)波長獨立、發(fā)射窄、長期光穩(wěn)定性和高量子產(chǎn)率等一些優(yōu)良的特性而被用于構(gòu)建靈敏度高、選擇性好、操作簡單等優(yōu)異性能的熒光檢測傳感器[17-18]。熒光納米顆粒在生物醫(yī)學(xué)和化學(xué)分析領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注,常用于金屬離子[19]、藥物殘留[20]和污染物分析[21]等,卻鮮見于有關(guān)食品安全分析的報道。其中,熒光硅納米顆粒(silicon nanoparticles,SiNPs)不僅水溶性好、光穩(wěn)定性強、無毒,且擁有較高的熒光量子產(chǎn)率和豐富的硅源,在分析檢測、生物成像和藥物傳遞等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[22-26]。

本研究建立一種無毒、快速和靈敏的熒光SiNPs探針檢測莧菜紅。以3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷為硅源,抗壞血酸為還原劑制備水溶性的熒光SiNPs,所制備的SiNPs熱穩(wěn)定性高,鹽穩(wěn)定性和水溶性良好。建立的測定莧菜紅的熒光分析方法具有快速、靈敏、高選擇性,并用于測定實際樣品中莧菜紅的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

碳酸飲料和水果糖購自當?shù)爻校?-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷,上海阿拉丁生化科技有限公司；L-抗壞血酸鈉、NaCl,天津市大茂化學(xué)試劑廠；葡萄糖、苯甲酸鈉,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；山梨酸鉀,天津市百世化工有限公司；檸檬酸,上海中秦化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸、檸檬黃,天津益仁達化工有限公司；莧菜紅,上海源葉生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Tecnai G2F30型透射電子顯微鏡,FEI公司；FTIR-650型傅里葉紅外光譜儀,天津港東科技股份有限公司；F-4700型熒光分光光度計,日立高新技術(shù)公司；TU-1810紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KO-500E超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；18100摩爾超純水機,上海摩勒科學(xué)儀器有限公司；Smart 140B智能磁力攪拌器,上海司樂儀器有限公司；Nova NanoSem 450型場發(fā)射掃描電子顯微鏡,上海禹重實業(yè)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 SiNPs的制備

SiNPs的制備參考江仁庭等[27]的方法并稍作修改：在4.0 mL去離子水中加入0.3 mL 3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷,50 ℃水浴攪拌5 min,然后加入0.084 g抗壞血酸繼續(xù)水浴攪拌6 h,形成SiNPs溶液。將所制備的SiNPs溶液透析(分子質(zhì)量截留：1 000 Da)16 h,然后儲存在4 ℃下供后續(xù)使用。

1.3.2 熒光測定

分別在2.0 mL pH 6.0的PBS緩沖液中加入1 mL上述SiNPs溶液,再加入不同濃度莧菜紅溶液,充分混合后放置90 s,在激發(fā)波長390 nm下測定其熒光光譜(激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm)。根據(jù)F0/F與莧菜紅濃度c繪制工作曲線(F0和F分別代表未加入和加入莧菜紅時的熒光強度)。實驗均在室溫下進行。

1.3.3 條件優(yōu)化

為了得到更靈敏的SiNPs,采用控制變量法對反應(yīng)體系的抗壞血酸的量及反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度進行了優(yōu)化：選擇抗壞血酸的質(zhì)量為0.02、0.042、0.063、0.084、0.105、0.126 mg；反應(yīng)時間設(shè)置為2、4、6、8和10 h;反應(yīng)溫度20、30、50、60、70 ℃。

1.3.4 穩(wěn)定性測定

制備濃度梯度為0、50、100、200、300、400、500、800和1 000 mmol/L的NaCl溶液,向SiNPs溶液中各加入800 μL上述NaCl溶液,混合均勻后在激發(fā)波長390 nm和發(fā)射波長500 nm下測定其熒光強度(激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm)。

設(shè)置水浴溫度為25、35、45、55、65、75、85和95 ℃,SiNPs溶液在各水浴溫度中進行水浴15 min達到設(shè)置溫度后,測定其熒光強度。

配制系列PBS緩沖液pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,向1 mL SiNPs溶液中分別加入上述2.5 mL PBS緩沖液,混合均勻后測定其熒光強度。

1.3.5 選擇性測定

配制18 μg/mL莧菜紅和1.8 mg/mL的檸檬酸、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、葡萄糖、抗壞血酸、Mg2+、Ca2+、Na+、K+溶液,各取3 mL加入到含有1 mL SiNPs溶液和2.5 mL pH 6的PBS緩沖液的試管中,搖勻并反應(yīng)90 s后進行熒光檢測。

1.3.6 樣品處理及其熒光測定

將飲料加熱以除去CO2,水果糖研細。稱取水果糖粉8.0 g用熱的超純水溶解,待冷卻后加水稀釋定容至25.0 mL,并于10 000 r/min下離心10 min,收取上清液備用。取制備好的各樣品溶液3.0 mL,加入到含有1 mL SiNPs溶液和2.5 mL pH 6的PBS緩沖液的試管中,搖勻并反應(yīng)90 s后進行熒光檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Office Excel 2010進行數(shù)據(jù)的整理,并用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 條件優(yōu)化

本實驗對SiNPs的合成條件包括抗壞血酸質(zhì)量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間進行了優(yōu)化。圖1-a顯示了SiNPs的熒光強度隨著抗壞血酸用量的變化情況,隨著抗壞血酸質(zhì)量的增加,熒光強度先逐漸增高后基本保持不變,當抗壞血酸質(zhì)量為0.084 g時,SiNPs溶液的熒光強度最大。如圖1-b所示,在2～6 h內(nèi),隨著反應(yīng)時間的增加,SiNPs溶液的熒光強度逐漸增強,在6～10 h內(nèi),隨著反應(yīng)時間的增加,熒光強度逐漸減弱,當反應(yīng)時間為6 h時,SiNPs溶液的熒光強度最高。如圖1-c所示,SiNPs溶液的熒光強度隨反應(yīng)溫度的增加而先增強后減弱,當反應(yīng)溫度為50 ℃時,SiNPs溶液的熒光強度最高。綜上所述,本實驗選擇0.084 g、6 h和50 ℃作為合成SiNPs的最佳還原劑用量、反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度。

圖1 不同抗壞血酸質(zhì)量(a),不同反應(yīng)時間(b)和不同反應(yīng)溫度(c)對SiNPs熒光強度的影響

2.2 表征

本實驗利用透射電鏡圖對SiNPs溶液的形態(tài)進行了表征。如圖2-a所示,實驗制備的SiNPs似球形、分散性較好。利用能量色散X射線光譜(energy dispersive X-ray spectroscopy,EDS)對SiNPs進行了元素分析,如圖2-b所示,SiNPs含有C、N、O、Si元素。圖2-c為SiNPs溶液的紅外光譜圖,3 002 cm-1處的峰為—OH的伸縮振動峰；1 630 cm-1處的峰為N—H鍵彎曲振動峰；1 120 cm-1處的峰為Si—O—Si的伸縮振動。結(jié)果表明,通過水熱法可以簡單有效合成粒徑較為均一SiNPs,而且SiNPs表面含有大量的氨基基團,這些官能團的存在極大地提高了SiNPs的水溶性。圖2-d為SiNPs溶液的紫外可見光譜圖和熒光光譜圖,由紫外吸收光譜可以看出,SiNPs的最大吸收波長為319 nm,從熒光光譜圖可知,當SiNPs的激發(fā)波長為390 nm時,發(fā)射波長為500 nm。圖2-e為SiNPs溶液在不同激發(fā)波長時的熒光發(fā)射譜圖,改變SiNPs的激發(fā)波長時熒光發(fā)射峰位置基本保持不變,表明SiNPs的熒光發(fā)射峰不具有激發(fā)波長依賴性[28]。

2.3 穩(wěn)定性

如圖3-a所示,由NaCl濃度從0～1 000 mmol/L變化時,SiNPs溶液的熒光強度保持較穩(wěn)定的狀態(tài),表明該SiNPs溶液具有較強的抗鹽性能；如圖3-b所示,當溫度從25 ℃升高到95 ℃時,SiNPs的熒光強度幾乎沒有變化,這表明SiNPs表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性。此外,在圖3-c中,隨著pH值從2.0增加到6.0,SiNPs的熒光強度逐漸增強,pH值從6.0增加到12.0,SiNPs的熒光強度逐漸減弱。

圖3 SiNPs在不同濃度的NaCl溶液(a)、不同溫度(b)、不同pH(c)下的熒光強度

2.4 SiNPs檢測莧菜紅

考慮到在實際檢測莧菜紅時,可能需要在較短的時間并在現(xiàn)場進行,本實驗考察了SiNPs對莧菜紅的響應(yīng)時間。如圖3-c所示,SiNPs在pH為6.0～8.0時的熒光強度比較穩(wěn)定。因此,本實驗選擇在pH為6.0的PBS緩沖溶液中進行。如圖4-a所示,SiNPs對莧菜紅的響應(yīng)時間非常短,所以選擇90 s為SiNPs和莧菜紅的響應(yīng)時間。如圖4-b所示,向SiNPs中加入不同濃度的莧菜紅溶液后,SiNPs的熒光強度隨莧菜紅濃度的增大而逐漸減弱。如圖4-c所示,熒光猝滅效率F0/F與莧菜紅溶液在2～20 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,其檢測限(3σ/k)為0.022 μg/mL,低于食品中莧菜紅的允許添加量,說明該方法可用于食品中莧菜紅的安全檢測。

圖4 SiNPs與莧菜紅的響應(yīng)時間(a)、不同莧菜紅濃度對SiNPs的熒光影響(b)、F0/F與莧菜紅濃度的線性關(guān)系圖(c)

2.5 選擇性

為了將該熒光猝滅法用于糖果和碳酸飲料中莧菜紅含量的測定分析,首先考察了可能的共存物質(zhì)(山梨酸鉀、葡萄糖、苯甲酸鈉、抗壞血酸和檸檬酸)和金屬離子(K+、Na+、Mg2+和Ca2+)對該反應(yīng)體系的影響。如圖5所示,干擾物質(zhì)對SiNPs的熒光強度影響較小,而莧菜紅對SiNPs的熒光強度影響最大,說明該熒光猝滅方法具有良好的選擇。

圖5 莧菜紅和其他干擾物質(zhì)對SiNPs的熒光強度影響

2.6 響應(yīng)機理

實驗對熒光猝滅機理進行了考察。如圖6所示,SiNPs的熒光激發(fā)光譜和莧菜紅的紫外吸收光譜幾乎沒有有效重疊,表明熒光猝滅機理不是內(nèi)濾效應(yīng)[29]。隨后對熒光共振能量轉(zhuǎn)移進行了研究。SiNPs的熒光發(fā)射光譜和莧菜紅的紫外吸收光譜具有較大的重疊面積,表明由莧菜紅引起的SiNPs溶液熒光猝滅作用是由于兩者間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移[30]。

圖6 莧菜紅的紫外-可見吸收光譜與SiNPs的熒光發(fā)射和激發(fā)光譜

2.7 樣品分析

采用標準加入法對碳酸飲料和水果糖中的莧菜紅含量進行了測定。結(jié)果見表1,樣品回收率為92.0%～104.0%,根據(jù)實驗測得碳酸飲料和水果糖中莧菜紅的含量低于GB 2760—2011《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》,表明食品中莧菜紅的含量符合食品衛(wèi)生標準。本方法準確可靠,可以采用此方法來測定食品中莧菜紅的含量。

表1 莧菜紅的回收率測定

3 結(jié)論

本實驗采用簡單的一步法快速合成了水溶性熒光SiNPs,該方法避免了材料的多步合成和耗時的修飾過程。所制備的熒光SiNPs具有良好的熱穩(wěn)定性、優(yōu)異的耐鹽性和pH穩(wěn)定性。利用SiNPs的優(yōu)異性能并依據(jù)莧菜紅能有效猝滅SiNPs熒光,建立了莧菜紅熒光檢測的快速有效方法,并應(yīng)用于食品中莧菜紅的含量測定。該方法以其優(yōu)異的選擇性和靈敏度為人們在食品安全中檢測色素添加劑提供了一種快速簡便的手段。基于SiNPs構(gòu)建的傳感器有望在食品安全監(jiān)測、環(huán)境樣品分析等方面得到更多應(yīng)用。