劉桂亮,廉貞霞,公丕學(xué),薛霞,劉艷明*,祝建華*

1(山東省食品藥品檢驗研究院,山東 濟南,250101)2(山東省食品藥品安全檢測工程技術(shù)研究中心,山東 濟南,250101)3(山東省藥學(xué)科學(xué)院,山東 濟南,250101)

二氫槲皮素又稱花旗松素、紫杉葉素、黃杉素、雙氫櫟精,是一種重要的二氫黃酮醇類化合物[1-2]。二氫槲皮素最早由日本學(xué)者FUKUI從針葉植物Chamaecyparisobtusa葉中分離[3],化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。由于二氫槲皮素特殊的結(jié)構(gòu)式且含有多個酚羥基,使其具有抗氧化[4-6]、抗炎、抗過敏[7-8]、調(diào)節(jié)酶活性[9]、緩解心血管系統(tǒng)疾病[10]、抗腫瘤[11-12]等一系列生物活性。

圖1 二氫槲皮素的結(jié)構(gòu)

根據(jù)國家食品安全風(fēng)險評估中心2020年11月12日行政許可征求意見[13],二氫槲皮素作為新的食品原料已通過專家評審委員會技術(shù)審查,擬作為新食品原料在食品中使用。歐盟和俄羅斯已批準落葉松來源的二氫槲皮素作為新食品原料。二氫槲皮素推薦食用量為≤100 mg/d,使用范圍和最大使用量為：飲料(20 mg/L),發(fā)酵乳和風(fēng)味發(fā)酵乳(20 mg/kg),可可制品、巧克力和巧克力制品(70 mg/kg)。目前國內(nèi)無上述3類食品基質(zhì)中二氫槲皮素相關(guān)的檢測方法和檢驗標(biāo)準。

二氫槲皮素檢測方法主要有分光光度法[14-15]、熒光法[16]、高效液相色譜法[17-21]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[22-24]等。分光光度法存在檢測靈敏度低、對食品提取溶液透光性要求高等局限性。熒光法檢測靈敏度雖高,但檢測準確性和靈敏度受復(fù)雜食品基質(zhì)影響比較大。高效液相色譜-質(zhì)譜法定性準確、靈敏度高,但在檢測過程中易受基質(zhì)干擾,影響定量結(jié)果的準確性,且儀器價格昂貴,普及率低。高效液相色譜法抗干擾能力強、檢測靈敏度高、對于目標(biāo)物分離效果好、定性定量準確,且高效液相色譜儀是分析實驗室普遍具備的儀器。因此高效液相色譜法更適合食品中二氫槲皮素的檢測。由于食品基質(zhì)復(fù)雜多樣,富含糖類、脂肪、蛋白以及各種維生素等物質(zhì),因此選擇合適的前處理方式十分重要。檢測食品中二氫槲皮素時,簡單的樣品前處理方式無法有效去除雜質(zhì),影響后續(xù)的定性定量結(jié)果。因此本實驗以國家允許添加二氫槲皮素的飲料、發(fā)酵乳和可可制品3種食品基質(zhì)為研究對象,對樣品前處理、色譜條件進行優(yōu)化,建立了固相萃取-高效液相色譜法測定食品中二氫槲皮素含量的方法。該方法為企業(yè)和監(jiān)管部門測定二氫槲皮素在食品中的規(guī)范使用提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

二氫槲皮素標(biāo)準品(CAS：480-18-2),上海安譜公司；甲醇、乙腈,均為色譜純,德國Merck公司；乙酸銨、乙酸,均為分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙酸,色譜純,美國Thermo Fisher公司；親水親脂平衡(hydrophile-lipophile,HLB)固相萃取柱(6 mL 200 mg),美國Waters公司。

2695型高效液相色譜儀配有二極管陣列檢測器,美國Waters公司；N-EVAP型控溫型氮吹儀,美國Organomation公司；3-18KS型高速冷凍離心機,德國Sigma公司；24針型固相萃取裝置,美國Supelco公司；MS-3型旋渦混合器,德國IKA公司；SB-800DTD型超聲波清洗器,寧波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q7000型超純水機,美國Millipore公司。

1.2 標(biāo)準溶液制備

稱取適量二氫槲皮素標(biāo)準品,以甲醇配制成1.00 mg/mL的標(biāo)準儲備液,于-18 ℃冰箱保存。用甲醇稀釋,得到0.8、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/mL系列標(biāo)準工作液。

1.3 樣品預(yù)處理

1.3.1 提取

分別稱取2 g(精確到0.01 g)飲料、發(fā)酵乳和可可制品于25 mL比色管中,加入20 mLV(甲醇)∶V(2%乙酸水)=1∶1提取液,充分渦旋分散混勻,超聲波清洗器中超聲提取30 min,冷卻至室溫后,用V(甲醇)∶V(2%乙酸水)=1∶1提取液定容至25 mL,混合均勻后,轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,8 000 r/min離心5 min,準確移取上清液5 mL至另一個50 mL離心管中,加20 mL超純水稀釋混勻后待凈化。

1.3.2 凈化

取HLB固相萃取柱,依次用5 mL甲醇、5 mL超純水活化,再將1.3.1所得待凈化液過固相萃取柱,控制流速不超過1 mL/min,待液體流盡后用5 mL超純水淋洗,將固相萃取柱抽干,再用6 mL甲醇洗脫,收集洗脫液,經(jīng)45 ℃水浴加熱氮吹至近干。用1 mL甲醇復(fù)溶,超聲10 min后渦旋混合,過0.22 μm微孔有機濾膜,供高效液相色譜分析。

1.4 儀器條件

色譜柱：XBridge C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)；柱溫35 ℃；流速0.8 mL/min；檢測波長290 nm；進樣量10 μL。流動相A：0.1%乙酸水溶液,流動相B：甲醇,采用梯度洗脫程序,梯度條件如表1所示。

表1 流動相梯度程序

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

在最優(yōu)的梯度洗脫下,本實驗考察了Atlantis dC18、XBridge C18、ACE C18、Atlantis T3C184款色譜柱。4款色譜柱分析得到的二氫槲皮素色譜峰除了保留時間不同,在峰形,靈敏度方面并沒有顯著差異。XBridge C18色譜柱對實際樣品分離效果較好,抗干擾能力更強,因此選擇XBridge C18色譜柱。

2.1.2 流動相的選擇

乙腈的截止波長在190 nm左右,甲醇的截止波長在210 nm左右,由于二氫槲皮素的最大吸收波長在290 nm左右,在二極管陣列檢測器下,甲醇和乙腈在基線噪音,減少干擾方面基本沒有太大差別。因此,基于經(jīng)濟最優(yōu)化和環(huán)境友好性方面的考慮,選用甲醇作為流動相。

實驗考察了超純水、酸化乙酸銨溶液(20 mmol/L)、乙酸水溶液體系作為流動相時對目標(biāo)物分析的影響。結(jié)果表明：用超純水進行洗脫時,流動相的洗脫能力明顯降低,需要更長的分析時間或者更強的洗脫梯度才能洗脫出目標(biāo)物,不利于復(fù)雜樣品分析中目標(biāo)物與雜質(zhì)間的分離;酸化乙酸銨溶液(20 mmol/L)和乙酸水溶液區(qū)別不大;乙酸水溶液作為流動相,基線較穩(wěn)定,290 nm波長下產(chǎn)生的波動較小,且相較于酸化乙酸銨溶液更加經(jīng)濟環(huán)保。因此,采用乙酸水溶液作為流動相。

對體積分數(shù)0.1%、0.5%、2%乙酸水溶液作為流動相產(chǎn)生的實驗效果進行比較,3個濃度水平區(qū)別并不明顯,都能得到很好的峰形和分離效果,因此選擇0.1%乙酸水溶液。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取

葡萄皮渣、落葉松等基質(zhì)中檢測二氫槲皮素的前處理方法一般有乙醇和熱水回流直接提取法[25]、超聲-微波交替法[26]等,將該前處理方法應(yīng)用到食品基質(zhì)中,發(fā)現(xiàn)無法有效去除雜質(zhì),并影響后續(xù)的定性定量結(jié)果,且實驗結(jié)果回收率偏低。根據(jù)二氫槲皮素易溶于乙酸、乙醇、沸水等溶劑的性質(zhì)特點,實驗選用2%乙酸水、甲醇-2%乙酸水(1∶1,體積比)、甲醇分別對樣品進行提取。結(jié)果發(fā)現(xiàn),食品樣品用2%乙酸水提取時回收率僅為39.3%,明顯低于甲醇-2%乙酸水、純甲醇的提取回收率。純甲醇的提取回收率為59.6%,比甲醇-2%乙酸水提取的回收率100.9%明顯低很多。因此,選用甲醇-2%乙酸水作為樣品提取劑。

實驗進一步考察了不同體積比例甲醇-2%乙酸水的提取效果,體積比分別是0∶1、1∶3、2∶3、1∶1、3∶2、3∶1、1∶0,樣品提取回收率見圖2,隨著提取液中甲醇比例的增加,提取效率不斷提高,而甲醇-2%乙酸水(1∶1)提取回收率最高。甲醇占比超過50%,繼續(xù)加大甲醇比例,提取效率逐漸下降。因此選擇體積比1∶1的甲醇-2%乙酸水為提取溶劑。

圖2 不同提取液對二氫槲皮素提取率的影響

2.2.2 凈化方式的選擇

固相萃取法具有快速、簡便、高效除雜的優(yōu)點,是目前使用最廣泛的凈化手段之一。為提高方法的靈敏度和準確性,對Oasis HLB、C18、Oasis PRiME HLB 3種固相萃取柱的凈化效果進行了比較,3種固相萃取(solid phase extraction,SPE)的具體操作條件見表2。

表2 三種SPE的凈化方法

經(jīng)SPE凈化后,結(jié)果如圖3所示。使用Oasis HLB凈化時二氫槲皮素回收率較高,而使用PRiME HLB和C18柱時回收率略低,為80%左右。PRiME HLB柱是一種通用型固相萃取柱,能去除磷脂、蛋白等雜質(zhì),經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該SPE對目標(biāo)物有吸附,造成回收率偏低。用C18柱凈化后雜質(zhì)干擾較多,不同基質(zhì)樣品凈化效果存在較大差異,回收率精密度較低。Oasis HLB柱的雜質(zhì)去除效果較好,干擾較少,回收率高,對不同基質(zhì)樣品凈化效果均較好,因此,選用Oasis HLB柱凈化該類樣品,提高了檢測的靈敏度和準確性。

2.2.3 凈化條件的選擇

上樣前將提取液用超純水稀釋5倍后上Oasis HLB柱。上樣后用5 mL超純水進行淋洗,洗去更多雜質(zhì)以提高其凈化效率。由于不同化合物之間極性差異,跟Oasis HLB柱填料的結(jié)合程度也不同。實驗考察了洗脫液甲醇的體積對二氫槲皮素回收率的影響,分別用1、2、4、6、8和10 mL甲醇洗脫目標(biāo)物,二氫槲皮素回收率如圖4所示,當(dāng)洗脫液體積為6 mL時,目標(biāo)物能被完全洗脫下來,繼續(xù)增大洗脫液體積時,回收率變化不明顯,且氮吹濃縮時間延長,因此,綜合考慮確定洗脫液的體積為6 mL。

圖4 不同體積洗脫液對二氫槲皮素回收率的影響

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍和檢出限

將二氫槲皮素系列標(biāo)準工作液按質(zhì)量濃度0.8、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0 μg/mL依次經(jīng)高效液相色譜儀進行分析測定,以二氫槲皮素標(biāo)準工作液質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),以響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo),繪制二氫槲皮素標(biāo)準工作曲線,在曲線范圍內(nèi),回歸方程為：Y=4.15×104X-9.29×103,線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9,線性良好。以信噪比S/N≥3計算檢出限,結(jié)果為0.6 mg/kg。以信噪比S/N≥10計算定量限,結(jié)果為2.0 mg/kg。

在本研究的條件下,對二氫槲皮素標(biāo)準品和實際樣品進行分析,色譜圖如圖5所示,二氫槲皮素標(biāo)準品色譜峰保留時間為11.814 min,具有良好的峰形和響應(yīng)值。飲料、發(fā)酵乳、可可制品3種食品基質(zhì)樣品中干擾物達到了有效分離,能夠較好地分析測定其中的二氫槲皮素。

圖5 二氫槲皮素標(biāo)準品(100.0 μg/mL)和實際樣品加標(biāo)(200 mg/kg)色譜圖

2.3.2 回收率和精密度

以飲料、發(fā)酵乳、可可制品3種食品基質(zhì)為研究對象,添加二氫槲皮素質(zhì)量分數(shù)為2、20、200 mg/kg 3個水平,經(jīng)上述方法處理后,測定樣品中的目標(biāo)物濃度,平行測定6次,進行相對標(biāo)準偏差(relative standard deviation,RSD)的計算,結(jié)果見表3。結(jié)果表明,二氫槲皮素的平均回收率在90.3%～102.5%,不同水平的加標(biāo)樣品重復(fù)測定6次,RSD為0.45%～1.42%,該方法能夠滿足實際樣品的檢測需要。

表3 添加回收率與精密度(n=6)

2.3.3 實際樣品分析

采用本文建立的方法對30批次市售飲料、發(fā)酵乳、可可制品進行二氫槲皮素的檢測,30批次產(chǎn)品均未檢出二氫槲皮素,可能是由于此前我國未批準二氫槲皮素作為食品原料在食品中使用,因此企業(yè)在食品生產(chǎn)過程中,沒有添加二氫槲皮素。

3 結(jié)論

本文建立了固相萃取-高效液相色譜測定食品中二氫槲皮素含量的方法,該方法前處理凈化效果好,液相色譜分析時干擾物明顯減少。本方法的靈敏度高,對于二氫槲皮素的定性、定量結(jié)果準確可靠,適用于飲料、發(fā)酵乳、可可制品等食品中二氫槲皮素含量的測定。