吳亞楠,鄒輝,劉玉茜,陳義倫

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 泰安,271000)

糖尿病作為一類以高血糖為主要特征的慢性代謝疾病,極易引起心腦血管疾病、視網(wǎng)膜病變、腎病等并發(fā)癥,危害人體健康且增加病患經(jīng)濟(jì)壓力[1]。受膳食、生活方式等眾多因素影響,2型糖尿病發(fā)病呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì),2019年全球成人糖尿病患者大概有4.63億,并預(yù)計(jì)到2030和2045年,糖尿病患者可能達(dá)到5.784和7.002億,其中2型糖尿病人數(shù)最多,占患病總?cè)藬?shù)的90%～95%[2-3]。目前,2型糖尿病的治療方法主要分為藥物治療和胰島素治療,而藥物治療存在毒副作用較強(qiáng),長(zhǎng)期服用可能會(huì)對(duì)人體的肝臟、腎臟產(chǎn)生潛在危害等問題[4]。將無毒副作用的天然產(chǎn)物用于輔助降血糖成為控制糖尿病的新方法[5]。研究表明,用于降血糖作用的天然產(chǎn)物主要有多糖類、黃酮類、皂苷類、生物堿及不飽和脂肪酸等,這些活性成分主要降糖作用途徑有保護(hù)胰島細(xì)胞促進(jìn)胰島素分泌、增強(qiáng)胰島素敏感、促進(jìn)葡萄糖的分解和改善糖脂代謝等[6]。多糖是存在于動(dòng)物、植物和微生物的一類大分子物質(zhì),具有較好的降血糖活性,研究發(fā)現(xiàn)多糖的降糖途徑主要有改善胰島素抵抗、保護(hù)胰島細(xì)胞增加胰島素的合成和提高糖代謝等[7]。深入研究不同天然多糖降糖效果、途徑,對(duì)精準(zhǔn)控制血糖,輔助治療糖尿病具有理論指導(dǎo)和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

蒲公英是一種藥食兩用蔬菜,富含多糖、多酚、甾醇、三萜等活性成分,傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究均表明,蒲公英具有輔助降糖作用,其中多糖是主要的降糖成分[8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,蒲公英多糖對(duì)糖尿病小鼠模型具有降血糖和抗氧化的作用,體外研究發(fā)現(xiàn),其可以抑制糖苷酶的活性,具有改善糖尿病的脂質(zhì)代謝和預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的作用[9-10]。來源、組成和結(jié)構(gòu)不同的多糖,其降血糖作用和途徑有所差異[11-13]。蒲公英的多糖主要存在于根中,先前的報(bào)道主要集中在粗多糖的降糖研究,但是并未探討蒲公英分離純化后的不同多糖組分的降血糖作用及其作用途徑[14],本研究將分離純化出的蒲公英根不同多糖組分進(jìn)行降糖作用及其作用途徑差異的研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與動(dòng)物

蒲公英根,山東泰安野菜種植基地,烘干磨粉后密封備用；鏈脲佐菌素、DEAE-52纖維素、Sephadex G-100、D101大孔樹脂、透析袋,北京索萊寶有限公司；總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、肝糖原試劑盒、葡萄糖含量試劑盒,南京建成有限公司；HepG2和NIT-1細(xì)胞,賽齊生物工程有限公司；1640培養(yǎng)基、DEME高糖培養(yǎng)基及其他細(xì)胞用品,賽默飛世爾生物制品有限公司；BI血清,上海逍鵬生物科技有限公司；基礎(chǔ)飼料、高脂飼料、墊料,山東濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司；其他試劑均為分析純。

4周齡健康雄性ICR小鼠,體重18～20 g,山東濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司(許可證號(hào)：SCXK(魯)20190003),小鼠置于18～22 ℃的室溫,相對(duì)濕度40%～60%,正常照明,自由獲取食物和水。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀,Molecular Devices公司；IX73研究級(jí)倒置熒光顯微鏡,奧林巴斯(中國(guó))有限公司；LC-20AD高效液相色譜儀、LC20凝膠滲透色譜儀,日本島津儀器公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蒲公英根多糖的制備及分子質(zhì)量、單糖組成測(cè)定

采用熱水浸提法[15]對(duì)蒲公英根多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化,最終優(yōu)化提取條件為：1 kg蒲公英根烘干研磨過40目篩,以料液比1∶25(g∶mL)的比例加入水,置于90 ℃的水浴鍋浸提3 h,收集濾液并濃縮。

用Sevage法除蛋白,向提取液中加入 1/3 倍體積的Sevage(氯仿∶正丁醇=4∶1,體積比)溶液,攪拌30 min,4 000 r/min 離心10 min,取上清液用80%的乙醇醇沉12 h,離心取沉淀,蒸餾水復(fù)溶,經(jīng)S-8大孔樹脂柱層析后,透析膜(分子質(zhì)量>3 500)室溫透析48 h,濃縮后凍干得到粗多糖。采用苯酚硫酸法[16]測(cè)得粗多糖的含量為34%。

取凍干粗多糖300 mg溶解于6 mL水中,過0.45 μm水系濾膜后上樣至DEAE-52離子交換柱上,分別用水、0.1 mol/L NaCl溶液、0.2 mol/L NaCl溶液洗脫至無多糖洗脫出來,收集3種洗脫組分透析 24 h以去除NaCl,再將3個(gè)組分分別上樣至sepG100層析柱,洗脫后透析24 h,濃縮凍干制得DP1、DP2、DP3這3種組分。

參考之前報(bào)道的方法[17-18],采用高效滲透凝膠色譜和高效液相色譜測(cè)定3個(gè)多糖組分的分質(zhì)量和單糖組成。

1.3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 動(dòng)物分組與處理

選取4周齡健康ICR雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機(jī)選取8只喂以正常飼料作為正常對(duì)照組(normal control,NC組),剩余32只喂以高脂飼料作為實(shí)驗(yàn)組,自由飲水,飼養(yǎng)1周后,實(shí)驗(yàn)組按30 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),正常組腹腔注射等量的生理鹽水,腹腔注射5 d后測(cè)血糖。測(cè)試之前禁食不禁水12 h,將空腹血糖值(fasting blood glucose,FBG)高于11.1 mmol/L的小鼠確定為造模成功[19]。將造模成功的小鼠按照血糖值平均分為4組,每組8只：糖尿病模型組(diabetes model control,DC組)、DP1多糖組(dandelion polysaccharide 1,DP1組)、DP2多糖組(dandelion polysaccharide 2,DP2組)、DP3多糖組(dandelion polysaccharide 3,DP3組)。正常組和模型組按100 mg/(kg·d)劑量生理鹽水進(jìn)行灌胃,其他組分別灌胃等劑量DP1、DP2、DP3,連續(xù)灌胃28 d[20]。

1.3.2.2 生化指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)過程中,每周測(cè)定1次小鼠的體重和空腹血糖水平。小鼠處死前進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test,OGTT)。將小鼠禁食不禁水12 h,用2.0 g/kg劑量葡萄糖溶液(葡萄糖質(zhì)量濃度400 mg/mL)進(jìn)行灌胃,隨后在0、30、60、90和120 min測(cè)量血糖水平。

給藥4周后,禁食12 h,脫頸處死之前,摘取眼球取眼眶血,將眼眶血3 500 r/min離心10 min取上層血清置于-80 ℃冰箱備用。脫頸處死,取肝臟組織,生理鹽水清洗去除組織上血跡,用濾紙吸干水分后,將組織一部分放入10%的福爾馬林溶液中固定用于形態(tài)觀察,另一部分置于-80 ℃冰箱中備用以測(cè)定生化指標(biāo)。將固定的肝臟標(biāo)本石蠟包埋并組織切片,切片用蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析[21]。

小鼠血清的甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、肝糖原含量指標(biāo)按照試劑盒要求測(cè)定。

1.3.3 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 細(xì)胞模型的建立

HepG2胰島素抵抗模型(insulin resistance,IR)的建立：將HepG2細(xì)胞均勻種于96孔板中,用濃度為10-7mol/L的胰島素培養(yǎng)細(xì)胞24 h,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞消耗量明顯減少(P<0.05),表明模型成功建立[22]。

NIT-1胰島損傷模型：將NIT-1細(xì)胞均勻種在96孔板中,用5 mmol/L的STZ溶液培養(yǎng)細(xì)胞30 min,即可建立胰島細(xì)胞損傷模型[23]。

1.3.3.2 葡萄糖消耗量試驗(yàn)

將HepG2細(xì)胞分5組(NC、DC、DP1、DP2、DP3)均勻種在96孔板后,等細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至孔80%以上,NC組加入200 μL DMEM完全培養(yǎng)液,其他組均加入200 μL 的10-7mol/L胰島素(胰島素先用DMSO配制母液后,用DMEM基本培養(yǎng)基配制)以建立胰島素抵抗模型,24 h后,NC組和DC組加200 μL DMEM完全培養(yǎng)液,DP1、DP2、DP3組分別加入200 μL 200 μg/mL的DP1、DP2、DP3(DP1、DP2、DP3用DMEM基本培養(yǎng)基制得)溶液,培養(yǎng)24 h后,取每個(gè)孔的上清液10 μL加入1 000 μL的葡萄糖試劑,置于37 ℃處理10 min,在波長(zhǎng)505 nm測(cè)定吸光度。按公式(1)、(2)計(jì)算葡萄糖含量及消耗量:

(1)

葡萄糖消耗量/(mmol·L-1)=空白組葡萄糖含量-實(shí)驗(yàn)組葡萄糖含量

(2)

1.3.3.3 MTT測(cè)定細(xì)胞活性

將NIT-1細(xì)胞分5組均勻種在96孔板后,等細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至孔80%以上,NC組加入200 μL 的1640完全培養(yǎng)基,其他組加入200 μL 2 mmol/L的STZ溶液(STZ是用1640基本培養(yǎng)基配制)以建立胰島細(xì)胞損傷模型,避光培養(yǎng)30 min后,將96孔板中液體倒干凈,NC組和DC組加200 μL 1640完全培養(yǎng)基,DP1、DP2、DP3組分別加入200 μL 200 μg/mL的DP1、DP2、DP3溶液(DP1、DP2、DP3用1640基本培養(yǎng)基制得),培養(yǎng)24 h后,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)平行3次,結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(x±s)表示。采用SPSS 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英根多糖組分制備

2.1.1 蒲公英根多糖的分離純化

經(jīng)過DEAE-52陰離子交換柱得到3種多糖組分(圖1-a),用sepG-100柱層析進(jìn)行純化后,得到了3個(gè)單一且對(duì)稱的峰(圖1-b)。

a-蒲公英根多糖DEAE-52洗脫曲線；b-蒲公英根多糖SepG-100柱層析洗脫曲線

2.1.2 蒲公英根多糖的分子質(zhì)量和單糖組成

由高效滲透凝膠色譜得到的3種多糖組分DP1、DP2、DP3的平均分子質(zhì)量分別是9 224、56 381、15 853 Da；根據(jù)單糖標(biāo)準(zhǔn)品和純化后的多糖液相色譜圖(圖2),可以看出DP1、DP2和DP3是由10種相同的單糖分別是：甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖,但含量比有所差異,DP1的含量比是0.09∶0.145∶0.03∶0.65∶0.02∶78.67∶0.12∶0.02∶0.09∶0.01；DP2的含量比為0.52∶0.121∶0.39∶0.88∶0.15∶53.70∶1.20∶0.42∶0.80∶0.10；DP3的含量比是1.03∶0.097∶1.99∶0.64∶1.61∶38.02∶3.66∶0.84∶1.84∶0.40。

a-標(biāo)準(zhǔn)單糖液相色譜圖；b-DP1液相色譜圖c-DP2液相色譜圖；d-DP3液相色譜圖

2.2 蒲公英根多糖組分對(duì)糖尿病小鼠改善效果

2.2.1 蒲公英根多糖對(duì)糖尿病小鼠的體重和FBG的影響

2型糖尿病體重會(huì)減輕而FBG會(huì)升高,主要是因?yàn)槭澄镏衅咸烟呛茈y進(jìn)入細(xì)胞提供能量,只能靠體內(nèi)蛋白質(zhì)和脂肪過分解提供[24-25]。對(duì)表1和圖3的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),NC組的小鼠體重逐漸增大,FBG的水平穩(wěn)定在正常值；而DC組組隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),體重呈逐漸下降的趨勢(shì),FBG呈逐漸上升的趨勢(shì)且始終高于11.1 mmol/L,說明建模成功；3種多糖干預(yù)組從第2周開始體重呈現(xiàn)緩慢回增的趨勢(shì),其中且FBG均顯著下降,降低FBG效果為：DP2>DP3>DP1,表明3種多糖組分均具有良好的降血糖效果,且DP2效果最佳。

表1 蒲公英根不同多糖對(duì)糖尿病小鼠體重的影響

圖3 蒲公英根不同多糖對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖值的影響

2.2.2 蒲公英根多糖對(duì)糖尿病小鼠口服耐受量的影響

OGTT是對(duì)葡萄糖的負(fù)荷水平的實(shí)驗(yàn),來測(cè)定胰島細(xì)胞對(duì)血糖的調(diào)控作用,正常人攝入糖后,血糖會(huì)明顯升高,但在2 h之內(nèi)恢復(fù)正常,而糖尿病患者則表現(xiàn)為耐受異常或紊亂。如圖4-a所示,NC組小鼠口服葡萄糖后,30 min時(shí)血糖值達(dá)到峰值,隨后血糖逐漸下降,在2 h時(shí)恢復(fù)至正常水平。相對(duì)于NC組,DC組小鼠在30 min后血糖值雖然也逐漸下降,但在120 min后血糖值仍處于高水平,這表明DC組小鼠糖耐量異常。DP1、DP2、DP3組在葡萄糖灌胃120 min后血糖基本回復(fù)到實(shí)驗(yàn)開始葡萄糖負(fù)荷前水平,說明3組多糖干預(yù)組的葡萄糖吸收和代謝的過程逐漸恢復(fù)正常。此外,如圖4-b所示,與NC組相比,DC組小鼠糖耐量曲線下面積升高了146.1%(P<0.05),與DC組相比,DP1、DP2、DP3分別降低了31.3%、44.7%、38.6%(P<0.05),說明DP1、DP2和DP3 3種多糖均能提高小鼠的糖耐力,且DP2的改善糖耐受效果最佳。

a-蒲公英根多糖對(duì)小鼠的口服糖耐受量的影響；b-蒲公英根多糖對(duì)小鼠的口服糖耐受量曲線下面積的影響

2.2.3 蒲公英根多糖對(duì)血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C水平的影響

高糖高脂喂養(yǎng)的2型糖尿病小鼠一般伴隨著血脂異常,顯著特征是TG、TC水平升高,在糖尿病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[26-27]。與相關(guān)研究一致[28],圖5結(jié)果表明,DC組小鼠血清TG、TC、LDL-C含量較NC組小鼠明顯增加,HDL-C的含量明顯下降(P<0.05),表明高糖高脂喂養(yǎng)可以導(dǎo)致血脂異常。與DC組相比,給予蒲公英根多糖干預(yù)后血清中TC、TG、LDL-C、含量明顯降低,HDL-C含量明顯升高(P<0.05),3種多糖組別之間差異不顯著,說明3種蒲公英根多糖均可以改善血脂異常。

a-蒲公英根不同多糖對(duì)血清中TG的影響；b-蒲公英根不同多糖對(duì)血清中TC的影響；c-蒲公英根不同多糖對(duì)血清中LDL-C的影響；d-蒲公英根不同多糖對(duì)血清中HDL-C的影響

2.2.4 小鼠肝臟的形態(tài)學(xué)變化

從HE染色圖中,NC組小鼠肝細(xì)胞排列整齊,形態(tài)清晰,細(xì)胞核清晰可見,血竇間隙排列良好,未見明顯的異常病理變化。與NC組相比,DC組肝細(xì)胞脂肪組織變性,細(xì)胞組織排列紊亂,肝血竇消失,部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變,肝細(xì)胞水腫變性,組織結(jié)構(gòu)紊亂。與DC組相比,多糖各處理組細(xì)胞排列相對(duì)有序,肝細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常,靜脈依然充血,表明3種蒲公英根多糖對(duì)肝臟具有一定的保護(hù)作用。

a-NC組對(duì)小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的影響；b-DC組對(duì)小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的影響；c-DP1組對(duì)小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的影響；d-DP2組對(duì)小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的影響；e-DP3組對(duì)小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的影響

2.3 蒲公英根多糖組分對(duì)糖尿病小鼠改善作用途徑

2.3.1 蒲公英根多糖對(duì)糖尿病小鼠的肝糖原含量的影響

糖代謝異常與2型糖尿病關(guān)系密切相關(guān),而肝糖原是機(jī)體內(nèi)很重要的一種糖原。如圖7所示,與NC組相比,DC組肝糖原含量明顯降低,說明造模成功；與DC組相比,DP1明顯提高肝糖原含量(P<0.05)可能是肝臟中將葡萄糖轉(zhuǎn)化為肝糖原的酶活性或數(shù)量得以提高,從而使合成的肝糖原增加；DP2和DP3雖也可以提高肝糖原含量,但與DC組差異不明顯。推測(cè)DP1可能是通過提高肝糖原含量,改善糖代謝途徑進(jìn)而降低血糖。

圖7 蒲公英不同多糖對(duì)糖尿病小鼠的肝糖原的影響

2.3.2 蒲公英根多糖對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞模型的葡萄糖消耗量影響

造成2型糖尿病的一個(gè)重要原因是胰島素抵抗,如圖8顯示,與NC組相比,DC組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05),而與DC組相比,不同多糖組均明顯提高了細(xì)胞的存活率(P<0.05)。與NC組相比,DC組葡萄糖消耗量顯著降低(P<0.05)；與DC組相比,不同多糖組的葡萄糖消耗量有所提升,其中DP2最佳,其次是DP3,最后是DP1(P<0.05)。DP2明顯提高IR模型的葡萄糖消耗量,改善胰島素抵抗,推測(cè)DP2可能是通過改善胰島素抵抗來降低血糖。

圖8 蒲公英不同多糖對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞存活率影響和的葡萄糖消耗影響

2.3.3 蒲公英根多糖對(duì)胰島細(xì)胞存活率的影響

如圖9所示,與NC組相比,DC組的胰島細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05),與DC組相比,DP3組明顯提高了胰島細(xì)胞的存活率(P<0.05),而DP1和DP2組存活率和DC組無明顯差異。DP3顯示了對(duì)受損胰島細(xì)胞明顯的保護(hù)作用,推測(cè)DP3可能是通過增強(qiáng)對(duì)胰島細(xì)胞的保護(hù)作用,從而促進(jìn)胰島素的分泌而降低血糖。

圖9 蒲公英不同多糖對(duì)受損NIT-1胰島細(xì)胞的保護(hù)作用

3 結(jié)論

本研究從蒲公英根中分離純化出了3種多糖,分子質(zhì)量分別為9 224、56 381、15 853 Da,單糖組成含量比不同的3種多糖組分DP1、DP2和DP3。3種多糖均具有不同程度的降血糖效果,且DP2降血糖作用效果最佳。多糖DP1對(duì)于改善糖代謝具有顯著影響,多糖均能緩解胰島素抵抗且DP2效果最佳,DP3能夠?qū)κ軗p胰島細(xì)胞具有一定的修復(fù)和保護(hù)作用,因此具有降血糖的作用。

研究表明許多植物多糖具有降糖作用效果,不同來源的植物多糖主要降糖作用途徑有差異[29]。黃參多糖的降血糖作用主要是減少自由基的數(shù)量,保護(hù)胰島β細(xì)胞,紅芪多糖主要是通過修復(fù)胰島細(xì)胞,促進(jìn)胰島素的釋放降糖;白簕多糖主要是增加肝糖原含量,調(diào)控糖代謝通路中的相關(guān)蛋白;黃精多糖在肝臟和胰腺中明顯上調(diào)胰島素受體蛋白(IRS-2)的表達(dá),減輕胰島素抵抗作用；植物多糖的降血糖作用可能與其分子質(zhì)量、單糖組成和聚合結(jié)構(gòu)有關(guān)[11],不同單糖組成的植物多糖具有不同的降血糖效果,分子質(zhì)量低的多糖無法形成具有生物活性的聚合結(jié)構(gòu)[7],單糖組合后的多糖比單糖降血糖效果更好。研究表明蒲公英主要通過促進(jìn)胰島素分泌、抗氧化、改善胰島素抵抗、調(diào)控糖代謝通路等機(jī)制發(fā)揮降血糖作用[30],降血糖成分包括多糖、黃酮、皂苷等,其中蒲公英多糖是主要降糖物質(zhì),本研究可以看出,由于3種蒲公英根多糖分子結(jié)構(gòu)的差異,使3種多糖具有不同的降血糖效果,并通過不同途徑發(fā)揮其作用,不同組分蒲公英根多糖與降血糖的構(gòu)效關(guān)系,需進(jìn)一步深入研究明確。