趙淑娜,焦愛權(quán),楊月月,吳文琪,金征宇*

1(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)2(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

啤酒以麥芽為主要原料,輔以酒花,接種啤酒酵母發(fā)酵而成,是世界上最古老的酒精飲料[1]。因其營養(yǎng)價(jià)值高、口感豐富,廣受各國人民喜愛。自2003年起,中國成為世界上最大的啤酒生產(chǎn)國和消費(fèi)國[2]。但國產(chǎn)啤酒大麥存在蛋白質(zhì)和葡聚糖含量偏高,酶系活力較低等缺陷,其質(zhì)量和數(shù)量都無法滿足本國啤酒工業(yè)生產(chǎn)的需求,我國年需求啤酒大麥一半以上依賴進(jìn)口,嚴(yán)重影響了我國啤酒企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[3]。

大麥芽是釀造啤酒的主要原料。大麥經(jīng)過潤濕,細(xì)胞代謝加快,一些水解酶被激活或合成,有利于后續(xù)淀粉、蛋白等大分子物質(zhì)的降解和利用[4]。但大麥發(fā)芽工序耗時(shí)耗能,且伴隨著嚴(yán)重的水污染。不少研究者嘗試直接用大麥作為原料輔以適當(dāng)?shù)耐庠疵钢苿┻M(jìn)行啤酒釀造。王秀麗等[5]研究了2種不同的復(fù)合酶制劑對100%大麥啤酒麥汁質(zhì)量的影響,結(jié)果表明未經(jīng)發(fā)芽的大麥在添加酶制劑糖化后也能得到合格的麥汁。朱明光等[6]選擇諾維信公司麥諾得復(fù)合酶釀造出風(fēng)味和營養(yǎng)都令人滿意的大麥啤酒飲料。全大麥啤酒釀造避開了制麥過程中的水熱消耗,消除了與麥芽生產(chǎn)相關(guān)的碳足跡,減少二氧化碳的排放,符合綠色生產(chǎn)理念[7],且由制麥導(dǎo)致的水分消耗和去除幼根的質(zhì)量損失也不復(fù)存在,大大降低了企業(yè)的生產(chǎn)成本[8]。通過添加外源酶制劑輔助糖化,可彌補(bǔ)大麥酶系活力不足、原料浸出率低等缺陷。但由于缺乏麥殼形成疏松的過濾層,麥汁過濾環(huán)節(jié)會發(fā)生一定程度的阻塞,且相比麥芽啤酒,大麥啤酒的口感較為單薄,顏色、亮度、醇和酯的含量偏低[9]。針對這些不足,不少研究提出相應(yīng)改善措施,譬如改變麥汁過濾方式以削弱阻塞、加入游離氨基氮調(diào)整啤酒的色澤與風(fēng)味等[9-10]?？傮w而言,全大麥啤酒釀造仍是一種極具前景的綠色釀造方式,解決了啤酒大麥的品質(zhì)制約問題,使啤酒生產(chǎn)更具可持續(xù)性[11]。

制麥處理會促使大麥中的淀粉、蛋白等生物大分子發(fā)生一定程度的降解,加速糖化過程[7]。而生大麥粉的細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為致密,在糖化前需做糊化處理才能更好的與糖化酶制劑作用。因此,采取一種行之有效的預(yù)糊化方式可有效提升全大麥啤酒的糖化效率、降低能源消耗、提高原料利用率。

加酶擠壓作為一種綠色、污染小的連續(xù)化生產(chǎn)技術(shù),在熟化淀粉基材料方面有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢,物料在擠壓腔內(nèi)受到的高溫剪切作用能夠?qū)崿F(xiàn)高料水比下酶與底物的良好作用。目前,加酶擠壓技術(shù)在糊化谷物方面的應(yīng)用早有報(bào)道。如啤酒輔料的熟化[12],高粱小曲酒[13]、黃酒[14]等發(fā)酵食品的生產(chǎn)。但尚未見加酶擠壓大麥粉直接進(jìn)行啤酒釀造的研究,加酶擠壓后的大麥粉產(chǎn)品的屬性也少見報(bào)道。

本文系統(tǒng)研究了加酶擠壓大麥粉的理化性質(zhì),主要是加酶擠出物的水合特性、熱性質(zhì)以及在擠壓腔內(nèi)的降解和酶蝕情況,對比了2種常規(guī)的熱處理方式(蒸汽蒸煮和高壓蒸煮)對大麥粉改性的差異。期望為全大麥啤酒釀造提供一種新思路,促進(jìn)國產(chǎn)啤酒大麥的進(jìn)一步利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大麥,江蘇無錫春播秋收電子商務(wù)有限公司；啤酒復(fù)合酶,和氏壁生物技術(shù)有限公司；耐高溫α-淀粉酶,上海麥克林生化科技有限公司；中性蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、β-葡聚糖酶、糖化酶,寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、NaOH、鹽酸均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FMHE36-24雙螺桿擠壓機(jī),湖南富馬科食品工程技術(shù)有限公司；L65高壓滅菌鍋,德國愛安姆科技有限公司；RQH-150智能人工氣候培養(yǎng)箱,鄭州生元儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機(jī),德國艾本德公司；25 mL密度瓶,上海申迪玻璃儀器有限公司；Waters 1525EF高效液相色譜,美國沃特世公司；恒溫水浴鍋,上海百典儀器設(shè)備有限公司；X-DSC7000差示掃描量熱儀,日本精工電子納米科技有限公司；RVA 4500快速黏度分析儀,澳大利亞波通公司；SU8100冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡,日本株式會社日立高新技術(shù)；HNY恒溫培養(yǎng)振蕩器,天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 預(yù)處理操作

大麥研磨后過80目篩,此為原大麥粉(raw barley,RAW),添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的耐高溫α-淀粉酶,混合均勻置于4 ℃冰箱中平衡一夜。設(shè)置擠壓溫度為90 ℃,進(jìn)料速度6.5 kg/h,螺桿轉(zhuǎn)速150 r/min,水分含量45%,擠出物冷凍干燥即得加酶擠壓樣品(enzymatic extrusion sample,EES)。蒸汽蒸煮樣品(steam cooking sample,SCS)：添加去離子水調(diào)節(jié)大麥粉的水分含量為45%,蒸汽蒸煮6 min后冷凍干燥。高壓蒸煮樣品(high-pressure cooking sample,HPS)：同樣調(diào)節(jié)大麥粉水分含量至45%,設(shè)置滅菌時(shí)間3 min,溫度為120 ℃,壓力0.2 MPa,在滅菌鍋溫度為85 ℃時(shí)放入樣品,程序結(jié)束后,在滅菌鍋溫度為85 ℃時(shí)取出樣品,冷凍干燥。所有干燥樣品均研磨至0.075 mm,于4 ℃冰箱中密封保存。

淀粉提取參照李靜鵬[15]的方法,得到大麥淀粉(raw barley starch,RAWS)、加酶擠壓淀粉樣品(enzymatic extrusion starch sample,EESS)、蒸汽蒸煮淀粉樣品(steam cooking starch sample,SCSS)、高壓蒸煮淀粉樣品(high-pressure cooking starch sample,HPSS),冷凍干燥后研磨至0.075 mm,于4 ℃冰箱中密封保存。

1.3.2 微糖化與發(fā)酵操作

微糖化：分別稱取100 g左右的3種熱改性大麥粉樣品于1 L玻璃燒杯中,按料水比1∶3.5(g∶mL)加入45 ℃,pH 6.5的去離子水,200 r/min攪拌3 min使大麥粉均勻成糊。加入1%的中性蛋白酶45 ℃水浴反應(yīng)15 min,隨后升溫至52 ℃,添加0.5 mol/L的檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至5.0～5.5,加入0.25%的α-淀粉酶,0.05%的啤酒復(fù)合酶制劑,0.02%的β-葡聚糖酶反應(yīng)1 h,反應(yīng)20 min后加入0.05%的β-淀粉酶繼續(xù)反應(yīng)至結(jié)束；再次升溫到62 ℃,添加0.5 mol/L的檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.0～4.5,加入0.075%的糖化酶反應(yīng)30 min；最后調(diào)節(jié)水溫至78 ℃,碘檢不變色則糖化結(jié)束。所有酶制劑添加量均按大麥干重計(jì)算,反應(yīng)間隔15 min或每次加酶后打開攪拌機(jī)攪拌0.5 min。

麥汁過濾后添加酒花煮沸1 h。趁熱過濾,迅速冷卻除去部分冷凝物,加入啤酒酵母進(jìn)行發(fā)酵,其中培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為16 ℃,通過監(jiān)測雙乙酰含量確定發(fā)酵溫度,雙乙酰含量降至0.1 mg/L時(shí)放入4 ℃冰箱貯存1 d,1 ℃保存留待檢測分析。

1.3.3 吸水性指數(shù)和水溶性指數(shù)測定

吸水性指數(shù)(water absorption index,WAI)和水溶性指數(shù)(water solubility index,WSI)的測定參考XU等[16]的方法,并稍作修改。稱取1 g左右的樣品與12 mL,pH 3.5的檸檬酸緩沖溶液混合于50 mL離心管中以滅活耐高溫α-淀粉酶。離心管置于30 ℃的水浴鍋中反應(yīng)30 min,7 500 r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至質(zhì)量恒定的鋁盒,105 ℃下干燥4 h至質(zhì)量恒定，記錄離心管及底部沉淀總質(zhì)量，同時(shí)將12 mL檸檬酸緩沖溶液干燥至質(zhì)量恒定,WSI和WAI分別按公式(1)、(2)計(jì)算：

(1)

(2)

式中:m,樣品質(zhì)量,g;m1,鋁盒質(zhì)量,g;mt,105 ℃下干燥4 h后質(zhì)量,g；mr,離心管及底部沉淀總質(zhì)量,g；m2,50 mL離心管質(zhì)量,g；mb,12 mL檸檬酸緩沖溶液干燥后質(zhì)量,g。

1.3.4 堆積密度測定

堆積密度(bulk density,BD)可在一定程度反映物料的膨脹程度。參考XU等[16]的方法,稱取約10 g樣品放入50 mL量筒中,緩慢而均勻的加入二甲基硅油至50 mL刻度處,然后將二甲基硅油轉(zhuǎn)移到另一個(gè)量筒中,記錄體積,BD按公式(3)計(jì)算：

(3)

式中：ρBD,堆積密度,g/mL;m,樣品質(zhì)量,g;V,樣品處理后體積,mL。

1.3.5 糊化度測定

采用酶法測定糊化度(gelatinization degree,GE),準(zhǔn)確稱取2份1 g左右的樣品與50 mL去離子水于250 mL錐形瓶中混合均勻,將其中1份置于沸水中水浴20 min使其完全糊化,迅速冷卻至室溫,此為糊化組。另1組不做糊化處理為對照組。向2組錐形瓶中各添加5 mL 30 mg/mL的TaKa淀粉酶,于恒溫培養(yǎng)振蕩器中氣浴振蕩(37 ℃,100 r/min)2 h后加入2 mL 1 mol/L HCl溶液滅酶,再加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液中和。過濾得到的上清液測定其還原糖含量,GE可表示為對照組與糊化組的還原糖含量的比值,按公式(4)計(jì)算：

(4)

式中：ρg、ρc,糊化組、對照組的還原糖含量,mg/mL；mg、mc,糊化組、對照組的樣品質(zhì)量,g。

1.3.6 糊化焓測定

使用差示掃描量熱儀(differential scanning calorimeter,DSC)測定樣品的糊化焓(ΔH)[17],稱取約2 mg樣品于鋁制坩堝中,加入2倍體積的去離子水,于4 ℃冰箱中平衡12 h,測試過程樣品以10 ℃/min 的加熱速率從20 ℃升到90 ℃,再以相同速率冷卻至20 ℃。使用Muse Jobs軟件計(jì)算糊化焓(ΔH)。

根據(jù)科學(xué)管理內(nèi)涵給我們的啟示是：一家企業(yè)是彼此合作的系統(tǒng)，只有這些愿意做且能做的人們朝著共同的目標(biāo)去努力，企業(yè)才能取得成功。

1.3.7 糊化特性測定

參照文獻(xiàn)[18],使用快速黏度儀(rapid visco analyzer,RVA)測定樣品的糊化特性。

1.3.8 掃描電鏡

用干凈的玻璃棒蘸取適量粉末樣品置于導(dǎo)電膠上,用洗耳球吹掃未黏附的樣品,將導(dǎo)電膠貼在樣品臺上,于真空條件下離子濺射噴金,在掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)下觀察淀粉的顆粒形態(tài),其中,加速電壓3 kV,放大倍數(shù)為1 500倍。

1.3.9 分子質(zhì)量分布

使用高效液相色譜測定不同熱處理后大麥粉中淀粉分子質(zhì)量分布。將提取出的淀粉溶于去離子水中,配制成10 mg/mL的溶液,于沸水浴中煮沸2 h使淀粉完全分散。使用Ultrahydrogel Linear色譜柱(7.8 mm×300 mm),流動(dòng)相為 0.1 mol/L NaNO3溶液,流速 0.8 mL/min,柱溫 40 ℃。所有樣品均用0.45 μm的一次性針頭濾器(水系)過濾。

麥汁中α-氨基氮含量的測定參照文獻(xiàn)[19]。通過高效液相色譜分析麥汁中可發(fā)酵糖(以葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖總量為指標(biāo))的含量。使用Sugar-Pak1色譜柱(6.5 mm×300 mm),流速 0.4 mL/min,流動(dòng)相為純水；柱溫 85 ℃。所有樣品均用0.45 μm一次性針頭濾器(水系)過濾。

1.3.11 成品啤酒酒精度測定

酒精度的測定參照文獻(xiàn)[20]中的密度瓶法,利用20 ℃時(shí)酒精水溶液與同體積純水的比重得到成品啤酒的酒精體積分?jǐn)?shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用 SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用 Origin 8.6進(jìn)行繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱處理大麥粉的水合特性

表1匯總了不同熱處理大麥粉的WAI、WSI、BD、GE和ΔH的值,由表1可知,熱處理后大麥粉的WAI值普遍上升,說明熱處理過程中淀粉顆粒被破壞,暴露更多的親水基團(tuán),結(jié)合水的能力提升[21]。

表1 不同熱處理大麥粉的WAI、WSI、BD、GE和ΔH的結(jié)果

WSI可作為原料分子損傷的指標(biāo),反映淀粉顆粒的水解情況,對發(fā)酵至關(guān)重要[22]。EES具有最大的WSI值(57.10%),表明淀粉經(jīng)加酶擠壓處理后降解程度最高,大量低聚糖和糊精溶出,水溶性增強(qiáng)。SCS的WSI小于原大麥粉,可能是由于緩沖溶液的質(zhì)量損失。

BD可反映樣品的膨脹或致密化程度,除了EES,SCS和HPS的堆積密度與RAW相比無顯著性差異(P<0.05),EES獲得最大的堆積密度,說明其降解效果最好。

2.2 不同熱處理大麥粉的糊化特性

由表1可知,熱處理后大麥粉的糊化度顯著提升,其中EES的GE值達(dá)到97.33%,幾乎完全糊化,3種熱處理對糊化度的影響存在顯著性差異(P<0.05),其大小排序?yàn)镋ES>HPS>SCS>RAW。

DSC是用來進(jìn)行淀粉糊化、老化分析的常見技術(shù)手段,從DSC譜圖中可得到糊化溫度和糊化焓等參數(shù)。由圖1可知,經(jīng)熱處理后,大麥粉的吸熱峰面積減小,起始糊化溫度前移。EES曲線無起伏,說明樣品在熱反應(yīng)過程中沒有發(fā)生熱量變化,即加酶擠出物完全糊化。由表1可知,EES的糊化焓未檢出,糊化焓大小排序?yàn)镽AW>SCS >HPS>EES,即糊化程度為EES>HPS>SCS>RAW,與上述GE的結(jié)果趨勢一致。

圖1 不同熱處理的大麥粉DSC熱力學(xué)參數(shù)

淀粉的糊化過程即淀粉在熱水中發(fā)生不可逆的溶脹,結(jié)晶區(qū)被破壞,直觀表現(xiàn)為淀粉糊的黏度增加。RVA通過精確的溫度控制程序,模擬淀粉糊化的水熱環(huán)境,通過檢測糊化過程的黏度變化,對淀粉進(jìn)行定性、定量分析[23]。圖2是4種樣品的RVA黏度曲線,熱處理后大麥粉的峰值黏度均顯著降低,尤其是加酶擠壓和高壓蒸煮處理樣品,黏度變化幾不可見,說明EES和HPS中淀粉糊化程度高,結(jié)晶區(qū)被完全破壞。

圖2 不同熱處理后大麥粉的RVA黏度曲線

2.3 不同熱處理大麥粉的顯微結(jié)構(gòu)

不同熱處理樣品與原大麥粉的掃描電鏡圖片如圖3所示,原大麥粉(圖3-a)中存在2種類型的淀粉顆粒,顆粒較大的呈光滑圓餅狀,顆粒較小的為球形,呈典型雙峰粒度分布,顆粒之間無黏連,與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致[24]。加酶擠出物(圖3-b)可以很明顯觀察到淀粉顆粒破碎,失去圓餅狀的淀粉形態(tài),部分碎塊發(fā)生聚集,表面粗糙且形狀不規(guī)則,這可能是由于擠壓腔內(nèi)的高溫高剪切環(huán)境加劇了淀粉的崩解。聚集體表面出現(xiàn)明顯孔洞和凹坑,可能是擠壓過程中的酶水解導(dǎo)致[25],促進(jìn)了可溶性物質(zhì)的浸出,有利于后續(xù)糖化酶的接觸作用。蒸汽蒸煮樣品(圖3-c)同樣出現(xiàn)淀粉顆粒的聚集,但聚集體中仍有部分淀粉保持光滑表面,可能是在低水分蒸煮條件下,淀粉糊化不均勻所導(dǎo)致。高壓蒸煮(圖3-d)后淀粉顆粒同樣呈聚集狀,表面出現(xiàn)大而密集的凹坑,部分降解為細(xì)碎的淀粉塊,相比于蒸汽蒸煮,淀粉顆粒破壞更嚴(yán)重,這是由于在密閉環(huán)境下的熱蒸汽不受樣品數(shù)量和大小限制,淀粉樣品受熱更加均勻[26]。

a-RAW;b-EES;c-SCS;d-HPS

2.4 不同熱處理大麥淀粉的降解情況

如圖4所示,根據(jù)體積排阻原理,出峰時(shí)間越早則物質(zhì)分子質(zhì)量越大,峰面積越大表明該分子質(zhì)量占比越大。原大麥淀粉出峰時(shí)間最早,且重均分子質(zhì)量(weight-averaged molecular weight,Mw)較大(Mw≈2.5×106g/mol)的淀粉分子所占比例最高,約74%。經(jīng)熱處理后,淀粉分子發(fā)生不同程度的降解,色譜峰出峰時(shí)間后移,大麥粉經(jīng)蒸汽蒸煮處理后,淀粉分子質(zhì)量仍呈雙峰分布,但大分子淀粉占比降低；高壓蒸煮樣品出現(xiàn)多個(gè)色譜峰,且拖尾嚴(yán)重,分子質(zhì)量分布在一個(gè)較寬的范圍,小分子糖類(Mw<103g/mol)約占25%；加酶擠壓樣品峰形變化最明顯,近70%淀粉分子被降解為低聚糖和可溶性糊精,高剪切和酶水解的協(xié)同作用使淀粉在低水分下實(shí)現(xiàn)了高度糊化和液化,降解效果明顯[27]。

圖4 不同熱處理后大麥淀粉的降解情況

2.5 麥汁和成品啤酒的品質(zhì)參數(shù)

對3種不同熱處理的大麥粉進(jìn)行微糖化實(shí)驗(yàn),糖化麥汁中可發(fā)酵糖(以葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖總量為指標(biāo))和α-氨基氮含量以及成品啤酒的酒精度如表2所示。可發(fā)酵糖約占麥汁浸出物的80%,是酵母繁殖必須的營養(yǎng)物質(zhì),對成品啤酒的酒精度和風(fēng)味特征都有很大影響[28]。調(diào)節(jié)麥汁糖度均為12°P的前提下,3種熱處理方式得到的麥汁可發(fā)酵糖占總糖的比例分別為81.58%、52.23%、71.68%,加酶擠壓獲得最高的可發(fā)酵糖占比,其次是高壓蒸煮以及蒸汽蒸煮。而普通麥汁的可發(fā)酵糖占比一般在70%左右,說明加酶擠壓和高壓蒸煮得到的啤酒麥汁符合發(fā)酵要求。

表2 不同熱處理大麥粉所得麥汁和成品啤酒的參數(shù)

氨基氮是酵母生長繁育的重要營養(yǎng)物質(zhì)，麥汁中α-氨基氮含量不能低于130 mg/mL，常濃發(fā)酵過程中為了實(shí)現(xiàn)麥汁的徹底發(fā)酵，氨基氮含量應(yīng)不低于150 mg/mL[29]。由表2可知，三種熱處理所得麥汁的α-氨基氮含量均能滿足發(fā)酵要求，但高溫高壓處理對糖化階段的氨基氮浸出更加有利。

EES得到的成品啤酒的酒精度滿足12°P麥汁釀得的啤酒酒精度要求(≥4.1%),而SCS和HPS得到的成品啤酒發(fā)酵效果不佳,乙醇濃度較低,可能是與可發(fā)酵糖的含量和組成有關(guān)。

3 結(jié)論

本文研究了3種熱處理方式(加酶擠壓、蒸汽蒸煮、高壓蒸煮)對大麥粉理化性質(zhì)的影響,根據(jù)不同熱處理后的產(chǎn)品屬性特征,結(jié)合釀造過程參數(shù),確定了其在全大麥啤酒釀造過程中的可能性。結(jié)果表明,加酶擠壓對大麥粉的理化改性使其在糖化過程中更具優(yōu)勢。加酶擠壓處理后,大麥粉的水合特性顯著增強(qiáng),WSI從2.98%升至57.10%,淀粉降解為黏度較低的低聚糖和糊精,大量可溶性物質(zhì)浸出。較高的糊化度和多孔的表面結(jié)構(gòu)使其更容易與糖化酶作用,所得麥汁的碳氮源物質(zhì)豐富,利于酵母生長繁殖,成品啤酒的酒精度符合國標(biāo)要求。但過濾阻塞以及口感淡薄的問題依然存在,如何優(yōu)化糖化酶制劑的添加量和種類,選擇合適的糖化程序仍然是全大麥啤酒釀造亟待解決的關(guān)鍵問題。但毫無疑問,加酶擠壓預(yù)處理為全大麥啤酒的釀造提供一種新思路,擠壓腔內(nèi)的高效剪切協(xié)同酶水解作用能夠在低水分下實(shí)現(xiàn)原料的糊化和液化,符合節(jié)能減排,綠色生產(chǎn)的要求,為全大麥啤酒的釀造奠定了基礎(chǔ)。