朱飛宇，徐慶梅，朱 建，湯 陽(yáng)，高 琴，唐 碧，康品方，王洪巨

（蚌埠醫(yī)學(xué)院 1.第一附屬醫(yī)院心血管科，2.心腦血管疾病基礎(chǔ)與臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3.生理學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233000）

心力衰竭（HF）是由于心臟功能的各種結(jié)構(gòu)或功能受損導(dǎo)致無(wú)法在正常充盈壓下維持心輸出量所致［1，2］。隨人口老齡化及城鎮(zhèn)化進(jìn)程的加速，中國(guó)心血管病呈明顯上升趨勢(shì)，且心力衰竭發(fā)病率高、預(yù)后差，年病死率高達(dá)40%［3］，慢性心力衰竭已成為重大公共衛(wèi)生問(wèn)題.導(dǎo)致慢性心力衰竭患者死亡的主要病種變化趨于一致，我國(guó)和歐美國(guó)家均以冠心病和/或高血壓為主。

有大量研究表明，人類和動(dòng)物模型中的慢性心力衰竭與炎癥有關(guān)［4］。心力衰竭中的無(wú)菌炎癥是由危險(xiǎn)相關(guān)分子模式（DAMPs）引發(fā)的，并已被證明可導(dǎo)致不可逆的心肌病變，例如纖維化，細(xì)胞凋亡和肥大［5-7］。DAMPs 激活Toll 樣受體引起通常包括核因子κB，Toll 樣受體4 信號(hào)和誘導(dǎo)炎性趨化因子，細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)而招募中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞。雖然這一過(guò)程最初在防止進(jìn)一步的組織損傷方面起到有益的作用，但如果持續(xù)，就會(huì)導(dǎo)致慢性炎癥。心臟壓力的升高和不良的泵功能直接觸發(fā)炎癥細(xì)胞的活化，例如外周單核細(xì)胞，這些細(xì)胞在心臟中聚集并釋放到循環(huán)中［8，9］。人PBMCs 包括單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，是慢性炎癥的重要參與者，能分泌包括IL-1β 和TNF-α 等在內(nèi)的多種細(xì)胞因子和化學(xué)介質(zhì)，介導(dǎo)炎癥的發(fā)生和發(fā)展。

NLRP3 炎性小體是一種細(xì)胞內(nèi)相互作用蛋白的復(fù)合物，可識(shí)別DAMPs 并觸發(fā)促炎細(xì)胞因子的成熟，從而引發(fā)和增強(qiáng)炎癥反應(yīng)［10-12］。NLRP3 炎性小體由核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（NOD）樣受體，細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣含有胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域蛋白（ASC）和半胱天冬酶組成。炎性體的形成導(dǎo)致半胱天冬酶-1（Caspase-1）活化。Caspase-1 進(jìn)一步切割各種底物，包括細(xì)胞因子白介素-1β 前體和白介素-18 前體［13］。IL-1β 是一種具有多種生物活性的前炎性因子，而白介素-18 是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，由PBMCs 及脾細(xì)胞等產(chǎn)生［14］，NLRP3 炎 性小體還可以caspase-1 依賴性方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［15］。通過(guò)細(xì)胞凋亡引起的心肌細(xì)胞損失減少了收縮儲(chǔ)備，導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)展［16］。在NYHA Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)患者，EF 降低（＜40%）的患者心肌組織中，發(fā)現(xiàn)急性心肌炎患者的樣本中含有更多的含炎性小體的白細(xì)胞［17］。雖然僅存在關(guān)聯(lián)性，并沒(méi)有顯示因果關(guān)系，但是在受損和受壓的心肌細(xì)胞中不斷增加的炎性小體，提示其在心力衰竭的發(fā)病機(jī)理和惡化中起了重要作用。盡管NRLP3 炎性體與慢性心力衰竭的發(fā)生有關(guān)，但不良的心肌重塑機(jī)制尚不完全清楚。有必要做進(jìn)一步的工作來(lái)闡明心力衰竭的發(fā)病機(jī)理和惡化的心肌重塑和修復(fù)機(jī)制。

因此，本研究旨在通過(guò)深入探討PBMCs 上NLRP3 炎癥體通路參與慢性心衰發(fā)生的分子機(jī)制，進(jìn)一步揭示NLRP3 炎癥體通路與慢性心衰之間的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，可能有助于對(duì)這一特殊疾病分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并且為治療和改善預(yù)后提供新方法和新策略，具有重要的科學(xué)價(jià)值和臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018 年10 月～2019 年12 月在本院接受治療的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)慢性心衰患者（NYHAⅡ～Ⅳ級(jí)）各20 例為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，慢性心力衰竭根據(jù)2018 年中國(guó)心力衰竭治療和診斷指南診斷［18］。臨床癥狀為急性感染、嚴(yán)重腎功能衰竭（血清肌酸水平＞3 mg/dL）或類風(fēng)濕性疾病，或懷疑有惡性或原發(fā)性消瘦障礙的患者被排除在本研究之外。選擇20 名健康人為對(duì)照組。本研究參與者年齡為41～84 歲，本研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)（中國(guó)蚌埠）批準(zhǔn)，并獲得所有受試者的書面知情同意。各組間年齡、性別、血糖水平、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、尿酸（UA）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 試劑

人外周血淋巴細(xì)胞分離液（北京索萊寶科技 有 限 公 司）；NLRP3 抗 體（Abcam 公 司lot：GR3192189-4）；ASC、Caspase-1 抗 體（Novus Biologicals 公 司CAT#DF6148，CAT#VF6304）；β-actin 抗體（protintech 公司Cat #20536-1-AP）；免疫磁珠試劑盒（STEMCELL Technologies 公司lot#19D1011661）；Trizol 試劑、熒光定量檢測(cè)試劑盒、第一鏈合成試劑盒（TIANGEN 公司CAT#DP405-02，CAT#FP205-02，CAT#KR106-02）；引物（上海生工生物工程有限公司），序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本準(zhǔn)備與PBMCs 分離 標(biāo)本準(zhǔn)備：通宵禁食后的清晨采集所有患者的外周血置于EDTA抗凝管中，2 h 內(nèi)以2 500 r/min 離心15 min，取離心后的上層血漿，血漿于-80 °C 保存。

PBMCs 分離：（1）在15 mL 離心管加入淋巴細(xì)胞分離液（稀釋血∶淋巴細(xì)胞分離液=1∶1）；（2）用生理鹽水將抗凝血稀釋1 倍，充分混勻。緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液層面上（將裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管傾斜，緩慢注入稀釋血，切勿沖散破壞液面分層），以2 000 r/min 離心20 min. 離心機(jī)溫度為20～25 ℃。（3）用移液管插到PBMC（云霧層混濁帶）層，沿管壁輕輕吸出此層細(xì)胞，把灰白色淋巴細(xì)胞層加入15 mL 離心管中并向該管加入生理鹽水至10 mL 重懸細(xì)胞；（4）4 ℃、3 000 r/min 離心7 min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，裂解5 min 后，4 ℃、1 500 r/min 離心10 min，再補(bǔ)滿生理鹽水繼續(xù)離心10 min。棄上清，繼續(xù)補(bǔ)滿生理鹽水繼續(xù)1 500 r/min 離心10 min。棄上清；（5）4 ℃、4 000 r/min 離心5 min。用移液槍吸出殘留液體，加入配置好的血清（胎牛血清∶二甲基亞砜=9∶1）重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至凍存管。-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 qRT-PCR 檢測(cè)NLRP3 通路相關(guān)基因在PBMCs 中的表達(dá)水平 使用TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（TIANGEN，cat.KR211）說(shuō)明書將RNA 轉(zhuǎn)化為cDNA，根據(jù)miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒（TIANGEN，cat.FP411）說(shuō)明書進(jìn)行熒光定量。用β-actin進(jìn)行校正，以正常組作為對(duì)照，用2-ΔΔt法進(jìn)行相對(duì)數(shù)據(jù)處理，計(jì)算炎癥相關(guān)基因的表達(dá)率。

1.3.3 Western blot 檢測(cè)NLRP3 通路相關(guān)蛋白在PBMCs 中的表達(dá)情況 使用前期提取的PBMCs，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 蛋白定量法（參照試劑盒說(shuō)明書操作）測(cè)定各組蛋白濃度，加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min。每組取50 μg 蛋白，10% SDS-PAGE 電 泳（60 V，30 min；90 V，100 min）；轉(zhuǎn)膜（200 mA，2～3 h）至PVDF 膜；5%脫脂牛奶室溫封閉4 h（或4 ℃過(guò)夜）；一抗室溫孵育4 h（或4 ℃過(guò)夜）；TPBS 洗滌3 次，10 min/次；二抗室溫孵育2 h；TPBS 洗滌3 次，10 min/次；ECL 發(fā)光試劑盒發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.3.4 ELISA 法檢測(cè)各組血漿中IL-1β 水平 根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明，使用ELISA 法測(cè)定血漿中IL-1β 水平，每組另設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，使用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)樣品中IL-1β 的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)使用Graphad prism6 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用（±s）表示，采用單因素方差分析、q檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定人PBMCs

結(jié)合CD14+抗體的人PBMCs 經(jīng)磁珠提純后，使用分選型流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定，得到的受試者PBMCs 純度大于90%。見(jiàn)圖1。

圖1 CD14+人外周血單核細(xì)胞鑒定Fig 1 Flow cytometric identification of CD14+ monocytes in each group

2.3 受 試 者PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1的mRNA 表達(dá)情況

qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 的mRNA 表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ組以上指標(biāo)表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Ⅲ組比較，Ⅳ組以上指標(biāo)表達(dá)水平升高。見(jiàn)表2。

表2 PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 的mRNA 表達(dá)情況（n=20，±s）Tab 2 mRNA expression levels of NLRP3，ASC，and caspase-1 in PBMCs（n=20，±s）

表2 PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 的mRNA 表達(dá)情況（n=20，±s）Tab 2 mRNA expression levels of NLRP3，ASC，and caspase-1 in PBMCs（n=20，±s）

組別對(duì)照組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組FP NLRP3 1.000±0.067 1.913±0.108 2.711±0.212 3.514±0.127 191.458＜0.000 1 ASC 1.000±0.123 1.435±0.097 1.854±0.092 2.131±0.069 77.71＜0.000 1 caspase-1 1.000±0.585 1.436±0.108 2.046±0.274 2.880±0.155 32.46＜0.000 1

2.3 受 試 者PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1蛋白的表達(dá)水平

Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 蛋 白的表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ組以上指標(biāo)表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Ⅲ組比較，Ⅳ組以上指標(biāo)表達(dá)水平升高。見(jiàn)表3、圖3。

圖3 PBMCs 中NLRP3，ASC，caspase-1 蛋白的表達(dá)水平Fig 3 Expression levels of NLRP3，ASC and caspase-1 in PBMCs

表3 PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 蛋白的表達(dá)水平（n=20，±s）Tab 3 Expression levels of NLRP3，ASC and caspase-1 in PBMCs（n=20，±s）

表3 PBMCs 中NLRP3、ASC 和caspase-1 蛋白的表達(dá)水平（n=20，±s）Tab 3 Expression levels of NLRP3，ASC and caspase-1 in PBMCs（n=20，±s）

組別對(duì)照組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組F P NLRP3 0.315±0.150 0.699±0.119 1.019±0.118 1.296±0.134 52.18＜0.000 1 ASC 0.303±0.110 0.507±0.123 0.754±0.106 1.103±0.195 43.54＜0.000 1 caspase-1 0.433±0.130 0.637±0.139 0.896±0.150 1.259±0.221 37.77＜0.000 1

2.4 外周血漿中IL-1β 含量

ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組IL-1β 表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ、Ⅳ組IL-1β 表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Ⅲ組比較，Ⅳ組IL-1β 表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 PBMCs 中IL-1β 的表達(dá)水平（n=20，±s）Tab 4 Expression levels of IL-1β in PBMCs（n=20，±s）

表4 PBMCs 中IL-1β 的表達(dá)水平（n=20，±s）Tab 4 Expression levels of IL-1β in PBMCs（n=20，±s）

組別對(duì)照組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組FP IL-1β 44.63±7.206 51.46±8.030 57.64±6.131 63.76±7.092 26.39＜0.000 1

3 討論

慢性心臟病與持續(xù)低級(jí)炎癥反應(yīng)相關(guān)，其促進(jìn)心臟不良重塑，并與疾病進(jìn)展相關(guān)［19，20］。心力衰竭是入院的最常見(jiàn)原因，這迫切需要增加對(duì)慢性心臟病的無(wú)菌性炎癥的理解，以便為其治療干預(yù)提供新途徑。越來(lái)越多證據(jù)表明，炎癥小體通過(guò)識(shí)別瀕死細(xì)胞釋放的危險(xiǎn)信號(hào)，在促進(jìn)無(wú)菌性炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而NLRP3 炎癥小體可以調(diào)節(jié)慢性炎癥對(duì)內(nèi)在宿主信號(hào)的反應(yīng)［21］。NLRP3 與接頭分子“含有CARD 結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白”（ASC）寡聚化，以響應(yīng)危險(xiǎn)信號(hào)，如ATP、尿酸鹽和膜脂質(zhì)［22，23］。NLRP3 和ASC 隨后招募半胱氨酸蛋白酶pro-caspase-1 生成稱為炎癥小體的caspase-1 激活平臺(tái)，炎癥小體的激活導(dǎo)致31 kDa 的白介素-1β 前體水解，裂解為17 kDa 的成熟形式，參與糖尿病等一系列慢性疾病的發(fā)病機(jī)制［24-28］。

研究表明血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、β 受體阻滯劑和醛固酮拮抗劑的對(duì)射血分?jǐn)?shù)低的心力衰竭患者有益［29］，然而，這些患者的高死亡風(fēng)險(xiǎn)表明，神經(jīng)激素的活化不能完全解釋心力衰竭的發(fā)展。心力衰竭中的炎癥細(xì)胞因子升高，并且它們的水平與心力衰竭的嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)［30］，這些細(xì)胞因子被認(rèn)為可以調(diào)節(jié)心肌重塑、心肌肥大和細(xì)胞凋亡、收縮力下降、纖維化增加以及其他不利的結(jié)構(gòu)變化［31-33］。最初的心力衰竭研究專注于單個(gè)細(xì)胞因子，但是，要揭示心肌重塑的病理生理過(guò)程，還需要進(jìn)一步研究炎癥途徑和細(xì)胞因子激活的潛在機(jī)制。

IL-1β 是一種促炎細(xì)胞因子，在細(xì)胞增殖、分化和 凋 亡 等 細(xì) 胞 活 動(dòng) 中 發(fā) 揮 作 用［34，35］。IL-1β 誘 導(dǎo) 心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣泄漏，損害心肌收縮力［36，37］。IL-1β刺激一氧化氮的產(chǎn)生，循環(huán)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶相應(yīng)增加，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和組織重塑［38］。IL-1β 在心力衰竭時(shí)升高，并與運(yùn)動(dòng)耐量差和缺血-再灌注損傷后的重構(gòu)有關(guān)［39，40］。調(diào)節(jié)IL-1β 可減輕心肌增大和心室功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組血清IL-1β 水平高于對(duì)照組（P＜0.05），Ⅲ組血清IL-1β水平高于Ⅱ組（P＜0.05），Ⅳ組血清IL-1β 水平高于Ⅲ組（P＜0.05），該結(jié)果提示IL-1β 可能參與了心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。

本研究通過(guò)提取患者PBMCs 并檢測(cè)NLRP3、ASC 及Caspase-1 信號(hào)通路的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組患者外周血NLRP3、ASC 及Caspase-1 mRNA 和蛋白質(zhì)含量均升高（P＜0.05）。結(jié)合患者血清炎癥產(chǎn)物IL-1β 的結(jié)果可以得出結(jié)論，慢性心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展可能與NLRP3-ASC-Caspase-1 信號(hào)通路誘導(dǎo)的炎癥活化有關(guān)。

總而言之，本研究發(fā)現(xiàn)慢性心力衰竭患者PBMCs 中NLRP3-ASC-Caspase-1 信號(hào)通路相關(guān)物質(zhì)表達(dá)明顯升高并伴有炎癥活化，此外隨心力衰竭級(jí)別的加重其水平升高更加顯著。但不足之處是，本研究樣本量較小，存在一定的局限性，此外實(shí)驗(yàn)未對(duì)PBMCs 中相關(guān)信號(hào)通路采取干預(yù)措施從而驗(yàn)證通路誘導(dǎo)的炎癥在心力衰竭中的具體作用。因此下一步可能需要設(shè)計(jì)前瞻性及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究進(jìn)一步確認(rèn)NLRP3 通路作用于慢性心力衰竭的具體機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

朱飛宇：進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，整理數(shù)據(jù)，撰寫論文。王洪巨、康品方：對(duì)論文內(nèi)容作出關(guān)鍵修正。徐慶梅：參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。朱建、湯陽(yáng)、高琴、唐碧：給與實(shí)驗(yàn)思路指導(dǎo)。