何志凌,龍文杰,招煦杰

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院心血管科,廣州 511000;2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科;3廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院重癥醫(yī)學(xué)科;*通訊作者,E-mail:vli321@163.com)

冠狀動(dòng)脈再通、及時(shí)恢復(fù)缺血心肌血液供應(yīng)是缺血性心臟病最常見的治療策略之一。血流的恢復(fù)可使梗死引起的損害最小化,從而降低死亡率。然而心肌再灌注損傷常引起氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),可能會(huì)導(dǎo)致額外的心血管損傷,稱為缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷[1]。目前I/R損傷的存在已成為影響心肌缺血治療效果亟待解決的重大難題。檀香是我國名貴藥材之一,據(jù)報(bào)道,檀香茶葉水提醇沉液在一定濃度時(shí)具有明顯加強(qiáng)衰竭離體蛙心正性肌力和增加心率作用[2]。此外,藏藥三味檀香散可能通過保護(hù)心肌線粒體結(jié)構(gòu)、改善缺血心肌的能量代謝和降低心肌中一氧化氮合酶活性對(duì)大鼠心肌缺血損傷起保護(hù)作用[3]。miR-199a-3p是一種內(nèi)源性短鏈非編碼RNA,最近研究表明miR-199a-3p在I/R心肌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),卡維地洛可能通過上調(diào)miR-199a-3p表達(dá)對(duì)I/R心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用[4]。此外,有研究指出miR-199a-3p可能通過不同的調(diào)控機(jī)制影響缺血預(yù)處理保護(hù)心肌I/R損傷[5]。本研究構(gòu)建心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)模型模擬I/R損傷過程,探討檀香提取物對(duì)大鼠心肌細(xì)胞H/R損傷的影響,分析其機(jī)制是否與調(diào)控miR-199a-3p表達(dá)相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

大鼠心肌細(xì)胞H9c2購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司;檀香葉購于佛山綠緣生態(tài)科技有限公司;miR-199a-3p模擬物(miR-199a-3p mimics)及其陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-199a-3p抑制物(anti-miR-199a-3p)及其陰性對(duì)照(anti-miR-NC)購于上海吉?jiǎng)P基因公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit 8,CCK-8)、膜聯(lián)蛋白異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于上海碧云天生物科技公司;兔源活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved Caspase-3)抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體、兔源B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma 2,Bcl-2)抗體、山羊抗兔IgG二抗購于美國Abcam公司;細(xì)胞乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)檢測(cè)試劑盒購于南京建成生物工程研究所;miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Fast qPCR Mix購于南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 H/R心肌細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建

復(fù)蘇H9c2細(xì)胞后,將其接種到DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的孵育箱中培養(yǎng),選擇對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用不含血清的DMEM培養(yǎng)基,并置于37 ℃、95% N2、5% CO2的孵育箱中培養(yǎng)10 h;接著更換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,并置于條件為37 ℃、5% CO2、95%空氣的孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)2 h,制備H/R損傷模型[6]。

1.3 檀香提取物的制備

參照文獻(xiàn)[7]方法制備檀香提取物。檀香葉陰干后,將檀香葉粉碎至0.3 mm,加入80%乙醇,在料液比為1 ∶10的條件下超聲處理10 min,浸提48 h后過濾,洗滌2次,合并濾液,將濾液減壓濃縮,并冷凍干燥,即得檀香葉粗提物,用無菌水稀釋成濃度為50 mg/ml的溶液備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理

為探究檀香提取物對(duì)H9c2細(xì)胞H/R損傷的影響,將H9c2細(xì)胞分為對(duì)照(control)組、模型(H/R)組、H/R+0.1 mg/ml檀香組、H/R+0.2 mg/ml檀香組、H/R+0.4 mg/ml檀香組。H/R+0.1 mg/ml檀香組、H/R+0.2 mg/ml檀香組、H/R+0.4 mg/ml檀香組為H9c2細(xì)胞進(jìn)行H/R處理后分別加入終濃度為0.1,0.2,0.4 mg/ml檀香提取物的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,Western blot檢測(cè)cleaved Caspase-3蛋白表達(dá),試劑盒檢測(cè)LDH和CK活性,RT-qPCR試劑盒檢測(cè)miR-199a-3p表達(dá)。

為檢測(cè)miR-199a-3p對(duì)H9c2細(xì)胞H/R損傷的影響,將miR-NC、miR-199a-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-199a-3p分別轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞,H/R處理后,依次標(biāo)記為H/R+miR-NC組、H/R+miR-199a-3p組、H/R+anti-miR-NC組、H/R+anti-miR-199a-3p組。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,Western blot檢測(cè)cleaved Caspase-3蛋白表達(dá),試劑盒檢測(cè)LDH和CK活性。

為驗(yàn)證檀香提取物是通過調(diào)控miR-199a-3p表達(dá)進(jìn)而影響H9c2細(xì)胞H/R損傷,將miR-NC、miR-199a-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-199a-3p分別轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞,H/R處理后,采用終濃度為0.4 mg/ml檀香提取物的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h,依次記為H/R+0.4 mg/ml檀香+miR-NC組、H/R+0.4 mg/ml檀香+miR-199a-3p組、H/R+0.4 mg/ml檀香+anti-miR-NC組、H/R+0.4 mg/ml檀香+anti-miR-199a-3p組。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,Western blot檢測(cè)cleaved Caspase-3蛋白表達(dá),試劑盒檢測(cè)LDH和CK活性。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

將H9c2細(xì)胞按照1×104個(gè)/孔接種于96孔板,按照上述實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行細(xì)胞處理,每孔加入10 μl的CCK8試劑,培養(yǎng)箱孵育4 h,酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的各組細(xì)胞吸光度值(OD),計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=處理組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將H9c2細(xì)胞按照2×105個(gè)/孔接種于6孔板,按照上述實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行細(xì)胞處理。收集各組細(xì)胞,用PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取105個(gè)細(xì)胞,加入195 μl的Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞,加入5 μl的PI輕輕混勻,輕輕混勻,室溫避光孵育20 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Western blot檢測(cè)cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平

采用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白,并測(cè)定蛋白濃度。取一定體積的蛋白樣品和等體積的2×上樣緩沖液混勻,沸水浴5 min變性后冷卻至室溫備用。制備濃縮膠和分離膠,按照每孔30 μg進(jìn)行上樣和聚丙烯酰胺凝膠電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近時(shí)停止電泳。取出凝膠,漂洗后,利用濕法轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。洗膜后,按照5%脫脂奶粉封閉,洗膜,一抗(cleaved Caspase-3抗體1 ∶500稀釋,Bcl-2抗體、GAPDH抗體1 ∶10 000稀釋)孵育,洗膜,二抗(1 ∶2 000稀釋)孵育,洗膜,化學(xué)發(fā)光顯色步驟依次進(jìn)行。凝膠分析系統(tǒng)采集圖像,以cleaved Caspase-3蛋白灰度值和內(nèi)參GAPDH蛋白灰度值比值表示cleaved Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 試劑盒測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH和CK活性測(cè)定

細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理后,收集各組H9c2細(xì)胞上清液,2 000 r/min離心20 min后取上清液,按照試劑盒說明書測(cè)定上清液中LDH、CK活性。

1.9 RT-qPCR試劑盒檢測(cè)細(xì)胞miR-199a-3p的表達(dá)水平

細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理后,采用Trizol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA,測(cè)定濃度和純度合格后,采用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,以cDNA為模板,利用SYBR Green Fast qPCR Mix進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。miR-199a-3p上游引物:5′-CAATCGCTTTCAAATAG-3′,下游引物:5′-CAGGAGATGCTGTCATC-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸35 s,35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-199a-3p的相對(duì)表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 檀香提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活性及凋亡的影響

與對(duì)照組相比,H/R組H9c2細(xì)胞cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與H/R組相比,H/R+0.1 mg/ml檀香組、H/R+0.2 mg/ml檀香組、H/R+0.4 mg/ml檀香組H9c2細(xì)胞cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著降低,Bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1,圖1)。

圖1 檀香提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 1 Effect of sandalwood extract on apoptosis and expression of related proteins in myocardial cells after hypoxia/reoxygenation

表1 檀香提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的細(xì)胞活性及凋亡的影響

2.2 檀香提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞受損程度及miR-199a-3p表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比,H/R組H9c2細(xì)胞miR-199a-3p的相對(duì)水平顯著降低,LDH和CK活性顯著增加(P<0.05);與H/R組相比,H/R+0.1 mg/ml檀香組、H/R+0.2 mg/ml檀香組、H/R+0.4 mg/ml檀香組H9c2細(xì)胞miR-199a-3p的表達(dá)水平顯著升高,LDH和CK活性顯著降低(P<0.05,見表2)。

表2 檀香提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞中LDH和CK含量的影響

2.3 過表達(dá)miR-199a-3p對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活性、凋亡及受損程度的影響

與H/R+miR-NC組相比,H/R+miR-199a-3p組H9c2細(xì)胞miR-199a-3p的相對(duì)水平顯著升高,cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著降低,LDH和CK活性顯著降低,Bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表3,圖2)。

表3 過表達(dá)miR-199a-3p對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活性、凋亡及受損程度的影響

2.4 抑制miR-199a-3p表達(dá)對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活性、凋亡及受損程度的影響

與H/R+anti-miR-NC組相比,H/R+anti-miR-199a-3p組H9c2細(xì)胞miR-199a-3p的相對(duì)水平顯著降低,cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著升高,LDH和CK活性顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表4和圖3)。

表4 抑制miR-199a-3p對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的細(xì)胞活性、凋亡及受損程度的影響

圖3 抑制miR-199a-3p對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of inhibition of miR-199a-3p on apoptosis and expression of related proteins in hypoxia/reoxygenation cardiomyocytes

2.5 抑制miR-199a-3p能逆轉(zhuǎn)檀香提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活性、凋亡及受損程度的影響

與H/R+0.4 mg/ml檀香+anti-miR-NC組相比,H/R+0.4 mg/ml檀香+anti-miR-199a-3p組H9c2細(xì)胞miR-199a-3p的相對(duì)水平顯著降低,cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著升高,LDH和CK活性顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表5和圖4)。

表5 miR-199a-3p抑制和檀香提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活性、凋亡及受損程度的影響

圖4 抑制miR-199a-3p能逆轉(zhuǎn)檀香提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Inhibition of miR-199a-3p reversed the effect of sandalwood extract on apoptosis and expression of related proteins in myocardial cells after hypoxia/reoxygenation

2.6 過表達(dá)miR-199a-3p能增強(qiáng)檀香提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活性、凋亡及受損程度的影響

與H/R+0.4 mg/ml檀香+miR-NC組相比,H/R+0.4 mg/ml檀香+miR-199a-3p組H9c2細(xì)胞miR-199a-3p的相對(duì)水平顯著升高,cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著降低,LDH和CK活性顯著降低,Bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5和表6)。

圖5 過表達(dá)miR-199a-3p能增強(qiáng)檀香提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Overexpression of miR-199a-3p enhanced the effect of sandalwood extract on apoptosis and expression of related proteins in myocardial cells after hypoxia/reoxygenation

表6 過表達(dá)miR-199a-3p能增強(qiáng)檀香提取物對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞細(xì)胞活性、凋亡及受損程度的影響

3 討論

檀香又名白檀香、浴香,是全球最重要的藥用植物之一。研究顯示,檀香提取物具有抗菌、抗氧化、抗癌等多方面藥理作用[7-9]。最近研究發(fā)現(xiàn)丹參-檀香配伍提取物對(duì)小鼠心肌缺血損傷具有一定的保護(hù)作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)H/R處理后,H9c2細(xì)胞存活率、抗凋亡蛋白Bcl-2顯著降低,細(xì)胞凋亡率和促凋亡蛋白cleaved Caspase-3的表達(dá)顯著增加,采用一定劑量的檀香提取物干預(yù)H/R處理的H9c2細(xì)胞后,心肌細(xì)胞的存活率、Bcl-2表現(xiàn)為明顯增加,而細(xì)胞凋亡率和cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)表現(xiàn)為明顯降低,說明檀香提取物對(duì)H9c2細(xì)胞I/R損傷具有良好的保護(hù)作用。缺血性心臟病發(fā)生時(shí),心肌組織中生成大量的活性氧,活性氧可直接損傷DNA,誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化和心肌細(xì)胞凋亡[11]。此外,大量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的釋放引起細(xì)胞膜通透性改變,破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),導(dǎo)致LDH和CK等心肌酶的大量釋放。因此,檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和CK活性是評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞受損程度的重要指標(biāo)[6,12]。本研究發(fā)現(xiàn)H/R處理后細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和CK活性表現(xiàn)為顯著增加,而一定劑量的檀香提取物干預(yù)可降低H/R處理H9c2細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和CK活性。以上研究說明,檀香提取物可減輕心肌細(xì)胞損傷程度,提高心肌細(xì)胞存活率,抑制細(xì)胞凋亡,對(duì)心肌細(xì)胞H/R損傷具有保護(hù)作用。

miRNAs是機(jī)體生理和病理過程的重要調(diào)節(jié)因子,在心臟生物學(xué)和疾病中具有重要的發(fā)揮重要作用[13]。miR-199a-3p是miR-199/214簇成員之一,Chen等[14]研究表明,在心臟發(fā)生過程中miR-199a-3p表達(dá)上調(diào),miR-199a-3p抑制劑可提高胚狀體的跳動(dòng)率,促進(jìn)心臟特異性標(biāo)志物的表達(dá)以及干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。Lesizza等[15]認(rèn)為單劑量心內(nèi)注射促再生性miR-199a-3p可顯著減少梗死面積,改善心肌梗死后的心臟功能。Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn),CRRL的缺失通過上調(diào)miR-199a-3p表達(dá)可促進(jìn)新生大鼠內(nèi)源性心肌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖,減輕心肌梗死后的重構(gòu),保護(hù)成年大鼠的心臟功能。本研究發(fā)現(xiàn)H/R處理后H9c2細(xì)胞中miR-199a-3p的表達(dá)顯著降低,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-199a-3p可提高H/R處理H9c2細(xì)胞的活力,抑制細(xì)胞凋亡,減輕細(xì)胞損傷程度,這與Torrini等[17]和Giacca等[18]miR-199a-3p具有誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖活性的結(jié)論基本吻合,與檀香提取物對(duì)H/R心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用一致。然而抑制miR-199a-3p表達(dá)后卻加重H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷和凋亡。而且進(jìn)一步研究顯示抑制miR-199a-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)檀香提取物對(duì)H/R心肌細(xì)胞的保護(hù)作用,而過表達(dá)miR-199a-3p能增強(qiáng)檀香提取物對(duì)H/R心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。以上研究說明檀香提取物通過上調(diào)miR-199a-3p表達(dá)對(duì)H/R心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。然而,檀香提取物中包含黃酮類、酚類物、有機(jī)酸以及氨基酸、多肽、多糖等多種活性成分[7],探究其發(fā)揮H/R心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用的活性組分將是下一步研究重點(diǎn)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)檀香提取物能通過上調(diào)miR-199a-3p表達(dá)顯著提高H/R損傷后細(xì)胞存活率,降低細(xì)胞凋亡率,減輕細(xì)胞損傷程度,對(duì)心肌細(xì)胞H/R損傷具有保護(hù)作用。