常玉珍 高紅云 史銀佩 王言景 吳玉芳 蔣沙沙

摘要 [目的]揭示小麥對條銹病的抗性應(yīng)答機(jī)制。[方法]以田間優(yōu)勢條銹菌接種抗病小麥品種賽德麥601和感病小麥品種鄭麥379，采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)和分光光度計法分析小麥籽粒中抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）的基因表達(dá)和酶活性變化。[結(jié)果]花后15 d，鄭麥379中APX和GR基因表達(dá)顯著升高，APX基因表達(dá)量升高幅度大，花后25 d上調(diào)至CK的11.45倍，且持續(xù)時間較長;GR短時間小幅度升高，在花后20 d升高至CK的1.65倍。賽德麥601中APX基因僅在花后20 d后表達(dá)量顯著升高，上調(diào)至CK的9.83倍，其他時期變化幅度很小;GR基因僅在花后25 d和花后30 d表達(dá)量顯著升高，分別升高至CK的2.09、1.92倍。APX和GR酶活性的變化與基因表達(dá)量的變化一致。[結(jié)論]APX和GR參與了小麥對條銹菌的抗性應(yīng)答反應(yīng)。

關(guān)鍵詞 小麥條銹菌;抗壞血酸過氧化物酶;谷胱甘肽還原酶;酶活;基因表達(dá)

中圖分類號 S-435.121.4+2? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）13-0108-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.026

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Effects of Stripe Rust on Gene Expression and Enzyme Activity of APX and GR in Wheat Grains

CHANG Yu zhen， GAO Hong yun， SHI Yin pei et al

（College of Life Science， Zhengzhou Normal University， Zhengzhou， Henan 450044）

Abstract [Objective]In order to reveal the mechanism of wheat resistance to rust.[Method]The changes of gene ex pression and enzyme activity of ascorbate peroxidase （APX） and glutathione reductase （GR） in wheat grains were analyzed by real time quantitative PCR and spectrophotometry after inoculating resistant wheat Saidemai 601 and susceptible wheat Zhengmai 379 with dominant stripe rust in the field.[Result]The results showed that the expression of APX and GR genes in susceptible cultivar Zhengmai 379 increased significantly at 15 days after anthesis （DAA）， and the expression of APX gene increased significantly to 11.45 times of the control at 25 DAA and lasted for a long time.And GR expression increased to 1.65 times of the control at 20 DAA.The expression of APX gene in resistant cultivar Saidemai 601 increased significantly at 20 DAA to 9.83 times? of the control;the expression of GR gene increased significantly only at 25 and 30 DAA， and reached 2.09 and 1.92 times of the control， respectively.The changes of APX and GR activity were consistent with the changes of gene expression.[Conclusion]This study showed that APX and GR were involved in the resistance response of wheat to stripe rust.

Key words Wheat stripe rust;Ascorbate peroxidas;Glutathione reductase;Enzyme activity;Gene expression

小麥條銹病是由條銹菌（Puccinia striiformis f.sp.Tritici）侵染引起的世界性氣傳病害[1]，具有危害性強(qiáng)和發(fā)生面積廣等特點(diǎn)，對小麥的產(chǎn)量與品質(zhì)造成嚴(yán)重影響。條銹病及其他逆境脅迫致使小麥植株過度積累H2O2等活性氧[2]，這些活性氧可直接攻擊膜系統(tǒng)中的不飽和脂肪酸，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能[3]。細(xì)胞內(nèi)有多種抗性酶，可有效清除活性氧，維持細(xì)胞的氧化還原平衡，保護(hù)植物免受傷害[4]。其中，抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）和谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）是抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)中的2個關(guān)鍵酶，APX可利用AsA將H2O2還原成H2O，GR可借助還原力NADPH催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原生成還原型谷胱甘肽（GSH），對GSH的再生、維持胞內(nèi)高比率 GSH/GSSG 及植物細(xì)胞的氧化還原平衡有重要意義[5]。前人研究發(fā)現(xiàn)，條銹菌侵染可使葉片APX基因表達(dá)升高[6]、活性增強(qiáng)[7-8]、GR活性降低[9]，感病小麥中活性氧水平比抗病小麥高[9-11]，這些研究集中于小麥的葉片，著重于對“源-流-庫”中“源”的變化，作為條銹菌直接侵染的營養(yǎng)器官，條銹菌活體寄生于葉片，葉片中抗性酶的變化很難排除寄生菌菌絲的影響。由于條銹菌沒有直接侵染籽粒，尚未發(fā)現(xiàn)針對“庫”器官籽粒中抗性酶變化的報道，籽粒的生理功能不同于葉片，其代謝與葉片的差異也較大[12]。由于籽粒未受到條銹菌的直接侵染，籽粒中抗性機(jī)制的研究更能說明小麥植株的整體變化。該研究以發(fā)育中的籽粒為材料，分析條銹菌與小麥互作中APX、GR基因表達(dá)及酶活性的變化，探討籽粒對條銹病的抗性應(yīng)答反應(yīng)，以豐富小麥的抗病機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 供試材料與田間處理

大田試驗(yàn)于2018—2019年在河南鄭州師范學(xué)院試驗(yàn)田（113.62°E，34.91°N）進(jìn)行。采用裂區(qū)設(shè)計，設(shè)置2個主處理，分別是對照區(qū)（CK）和條銹病發(fā)病區(qū)（T），2個區(qū)間隔20 m，間隔區(qū)域種植抗病品種賽德麥601作為隔離行，使其保護(hù)隔離。副處理為抗病性不同的2個冬小麥品種，分別為抗病品種賽德麥601和感病品種鄭麥379。副區(qū)面積為2 m×3 m，副區(qū)間間隔1 m。對照區(qū)的副區(qū)之間種植0.5 m的抗病品種作為隔離行，發(fā)病區(qū)的副區(qū)之間種植感病品種作為誘發(fā)行，誘發(fā)小麥條銹病發(fā)病。于2019年4月28日開始，將感條銹病葉片撒入感病區(qū)進(jìn)行接種，每隔5 d接種1次，使其發(fā)病。其他管理同一般高產(chǎn)田。

1.2 田間取樣與條銹病調(diào)查

在花后15 d（15 DAA）、20 d（20 DAA）、25 d（25 DAA）和30 d（30 DAA）進(jìn)行取樣，選取典型的病情差別較大的植株麥穗，剝?nèi)∷胫胁康淖蚜?，?80 ℃超低溫冰箱保存。

使用小麥0～9級調(diào)查方法[13]，調(diào)查取樣植株的旗葉、倒二葉、倒三葉的感病程度，以病斑占葉片面積百分比進(jìn)行分級。公式為DI=Σ（各級病葉數(shù)×發(fā)病級別）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級別）×100。

1.3 酶活性測定

粗酶液提取參考朱祝軍等[14]的方法，APX活性測定參照Nakano等[15]的方法。以1 h氧化1 μmol AsA的酶量為1個酶活單位[μmol/（g·h）]。GR活性測定參照文獻(xiàn)[16]的方法，以1 h消耗1 μmol NADPH2的酶量為1個酶活單位[μmol/（g·h）]。

1.4 基因表達(dá)測定

參照楊陽[17]的方法提取小麥總RNA，用紫外分光光度計測定RNA濃度，吸光值OD260/OD280值為1.8～2.0，說明所提總RNA質(zhì)量良好。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA）說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)APX和GR的GeneBank登錄號，用 Primer Premier 5.0 / NCBI Primer-blast設(shè)計引物，在小麥基因組網(wǎng)站（http：//plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Transcript/Sequence_cDNA）尋找這2個基因的同源序列，通過Snapgene軟件將設(shè)計好的引物與其進(jìn)行比對，篩選出特異性引物序列（表1），選用小麥肌動蛋白基因（Actin）作為內(nèi)參基因，引物由河南尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

依據(jù)試劑盒（TAKARA）使用說明進(jìn)行qRT-PCR，采用20 μL擴(kuò)增體系，每個樣品設(shè)3次重復(fù)。對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證抗性酶基因引物擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量。

1.5 統(tǒng)計分析方法

采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行均值及標(biāo)準(zhǔn)誤差分析。使用相對定量法進(jìn)行基因的表達(dá)分析，用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)結(jié)果采用Excel 2003和SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥植株條銹病調(diào)查結(jié)果

對取樣的小麥植株進(jìn)行病情調(diào)查，結(jié)果（表2）顯示，無論是抗病品種還是感病品種，CK的病情指數(shù)均為0。15 DAA時期，抗病品種開始發(fā)病，病情指數(shù)為0.67，在25 DAA和30 DAA時期病情指數(shù)分別為4.23和4.57，整體上病情較輕;感病品種在15 DAA時期病情指數(shù)已達(dá)7.65，在20 DAA病情指數(shù)升高至26.98，隨后一直持續(xù)升高至30 DAA，病情較為嚴(yán)重。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶見圖1，與設(shè)計片段長度一致。

2.3 小麥條銹病對APX基因表達(dá)量及酶活性的影響

從圖2可見，接種條銹菌10 d后，即在15 DAA時期，抗病品種賽德麥601中APX基因表達(dá)量略有升高（為CK的1.41倍），在20 DAA有一個大幅度的上調(diào)表達(dá)，上調(diào)至CK的9.83倍，在15和20 DAA時期均達(dá)到顯著差異水平（P<0.01），在25 DAA、30 DAA時期恢復(fù)至與CK較為接近的水平。整體上抗病品種除了20 DAA時期上調(diào)幅度較大之外，其他時期變化幅度很小，是CK的1.08～1.41倍。感病品種鄭麥379的APX基因表達(dá)持續(xù)升高，15 DAA至25 DAA時期，表達(dá)量分別是CK的5.45、1.82和11.45倍，15 DAA至25 DAA時期均達(dá)到差異顯著水平（P<0.05），在30 DAA時期，恢復(fù)至與CK幾乎相同的水平。

從圖3可見，接種條銹菌對小麥籽粒APX酶活性也產(chǎn)生了顯著影響，抗病品種賽德麥601 APX酶活性呈持續(xù)升高趨勢，升高幅度是CK的0.14～1.10倍，僅25 DAA時期幾乎沒有變化，酶活性變化趨勢與基因表達(dá)一致。感病品種鄭麥379的APX酶活性在15 DAA～30 DAA時期持續(xù)升高，達(dá)到顯著差異水平（P<0.05），升高幅度在25 DAA時期高達(dá)5.34倍，高于抗病品種的升高幅度，APX酶活性的變化與基因表達(dá)量的變化一致。

在條銹病發(fā)病較為嚴(yán)重的時期（15 DAA～25 DAA），抗病品種賽德麥601在20 DAA時期APX基因表達(dá)和酶活性升高，推測APX表達(dá)和酶活的升高會使細(xì)胞內(nèi)的ASA、GSH等消耗，以清除該時期驟然升高的活性氧。隨后，在25 DAA時期抗病品種賽德麥601的APX表達(dá)和酶活性與CK持平，推測是籽粒細(xì)胞中活性氧恢復(fù)至正常水平，處于一種較為穩(wěn)定的氧化還原狀態(tài)，這可能是抗病品種對條銹菌脅迫的抗性應(yīng)答反應(yīng)。而感病品種鄭麥379的APX表達(dá)和酶活性持續(xù)升高，推測是細(xì)胞中的活性氧水平較高，未得到及時、有效清除所致。

2.4 小麥條銹病對GR基因表達(dá)量及酶活性的影響

由圖4、5可知，抗病品種賽德麥601的GR基因表達(dá)量在15 DAA和20 DAA時期與CK相差不大，在25 DAA和30 DAA時則顯著升高（P<0.05），分別為CK的2.09、1.92倍;GR酶活性的變化與基因表達(dá)量的變化相同，在15 DAA、20 DAA與CK相差不大，而在25 DAA和30 DAA時期則顯著升高，升高至CK的1.27、2.11倍?？共∑贩N賽德麥601中GR基因表達(dá)水平和酶活性在25 DAA、30 DAA時期的升高，推測與細(xì)胞中GSH水平的升高有關(guān)。

感病品種鄭麥379的GR基因表達(dá)量在15 DAA和20DAA時期顯著升高（P<0.05），分別是CK的1.43倍和1.65倍，在25 DAA和30 DAA顯著降低（P<0.05），分別是CK的0.76倍和0.65倍，呈先升高后降低的趨勢。GR酶活性也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在20 DAA時期也顯著升高（P<0.05），比CK升高1.15倍，在25 DAA和30 DAA時期顯著降低，這種變化與基因表達(dá)量的變化一致。在15 DAA和20 DAA時期GR基因表達(dá)水平和活性升高推測細(xì)胞中GSH水平較高，GSH中的活潑巰基可增強(qiáng)小麥籽粒的抗氧化能力。

3 結(jié)論與討論

該研究結(jié)果表明，不同感病性的小麥，籽粒APX和GR基因表達(dá)與活性對條銹病的應(yīng)答也不同。條銹菌侵染抗病品種后，APX基因表達(dá)和酶活性在籽粒發(fā)育中期短時間驟增后恢復(fù)正常水平，GR基因表達(dá)和酶活性在籽粒發(fā)育后期升高。田間條銹病較嚴(yán)重的20 DAA時期，抗病品種賽德麥601雖然病情指數(shù)較低，但是細(xì)胞內(nèi)APX表達(dá)和酶活性驟然升高，推測是應(yīng)答該時期活性氧的驟然升高所致，引起ASA短時間被大量消耗而降低。前人有關(guān)葉片的研究也證實(shí)，條銹菌侵染可引發(fā)H2O2含量升高，ASA含量降低[9，11]，與該研究ASA含量降低的推測一致?？共∑贩N賽德麥601的GR基因表達(dá)和活性僅在25 DAA和30 DAA時期有所升高。有研究也發(fā)現(xiàn)，抗病小麥接種條銹菌1、2和5 d后，會引起葉片GR活性的升高[9]，脅迫條件下GR酶活性的增加，有利于提高植物的耐受性[18-19]。由于GR對GSH的再生，維持細(xì)胞的氧化還原平衡具有重要意義[5]，推測25 DAA、30 DAA時期細(xì)胞中GR表達(dá)和活性的升高可引起GSH水平升高，以維持細(xì)胞內(nèi)高比率 GSH/GSSG 及氧化還原平衡，這與該時期APX表達(dá)和酶活性恢復(fù)至正常水平的結(jié)論一致，在抗病品種中，APX和GR起到接力的作用，APX在前，GR在后，依次應(yīng)答條銹菌侵染。

條銹菌侵染感病品種后，APX基因表達(dá)和酶活性在籽粒發(fā)育4個時期持續(xù)升高，GR基因表達(dá)和酶活性在籽粒發(fā)育中期短時間升高后降低。15 DAA至30 DAA時期，感病品種鄭麥379的APX表達(dá)和酶活性持續(xù)升高，推測籽粒細(xì)胞處于較高的活性氧水平，未得到有效清除。前人關(guān)于葉片的研究顯示，條銹菌侵染使得感病小麥比抗病小麥積累了更高水平的活性氧[20]，APX基因表達(dá)升高[6]，APX活性增強(qiáng)[7-8]，這與該研究籽粒中的變化一致。白粉菌、稻瘟病菌（Pyriculariaoryzae）等其他真菌侵染小麥后也發(fā)現(xiàn)葉片中APX活性升高[21-22]，另有白粉菌侵染大麥引發(fā)葉片中APX活性持續(xù)升高的報道[23]。有研究發(fā)現(xiàn)有關(guān)小麥白粉病引發(fā)籽粒APX在蛋白水平的表達(dá)升高[24]。這些研究與該研究結(jié)論一致。該研究結(jié)果表明，感病品種鄭麥379的GR基因表達(dá)和酶活性在20 DAA短時間升高后，在25 DAA、30 DAA時期降低，推測這個短暫的升高有助于細(xì)胞中H2O2等活性氧水平的降低，但不足以降低至正常的活性氧水平，這種持續(xù)的、高水平的活性氧最終引發(fā)小麥?zhǔn)艿窖趸瘬p傷，導(dǎo)致后期GR基因表達(dá)和活性的降低。前人也有關(guān)于條銹病引發(fā)感病小麥葉片GR活性降低的報道[9]，與該研究25 DAA、30 DAA時期的降低一致。

綜上所述，感病品種清除活性氧的能力有限，條銹病可誘發(fā)感病品種APX基因表達(dá)和活性持續(xù)升高以應(yīng)對銹病引發(fā)的H2O2持續(xù)積累，而GR基因表達(dá)和活性短暫升高后降低。而抗病品種可有效清除細(xì)胞中短時間升高的活性氧，條銹病可誘發(fā)抗病品種APX基因表達(dá)和活性升高，GR基因表達(dá)和活性的升高略為滯后，以維持細(xì)胞中的氧化還原狀態(tài)的平衡，這可能是抗病品種抗性的一種體現(xiàn)。

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