王 丹 尹燕娜 裴 燕 孫本紅 張淑英 任愛新

新疆軍區(qū)總醫(yī)院北京路醫(yī)療區(qū)(烏魯木齊，830012)

上皮性卵巢癌是一種婦科常見惡性腫瘤，在卵巢部位腫瘤中占50%以上。由于早期病情隱匿，70%患者就診時已為晚期，患者5年生存率最高僅40%，與其他婦科惡性腫瘤比較死亡率較高[1]。盡管近年來手術、放化療等治療水平有一定提高，患者生存情況仍未得到明顯改善。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，Gasdermin-D(GSDMD)在胃癌組織中表達水平降低，可使細胞外相關信號蛋白上調影響胃癌細胞周期，促進胃癌細胞體內(nèi)外增殖[2]。有研究表明，二甲雙胍誘導GSDMD高表達后細胞焦亡被激活，食管鱗癌患者病情進展受到抑制，可作為放化療替代治療手段[3]。Zhu等研究證實，半胱氨酸蛋白酶4(Caspase-4)過表達可抑制乳腺癌細胞增殖和腫瘤發(fā)生，可能作為臨床治療乳腺癌靶點[4]。由于GSDMD可由炎性因子Caspase-4激活，特異性參與細胞焦亡細胞凋亡過程[5]，本研究通過檢測上皮性卵巢癌組織中GSDMD、Caspase-4蛋白表達情況，探究二者與患者臨床病例病理特征及預后關系，以期為臨床靶向治療提供一定思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年9月—2014年9月本院收治的上皮性卵巢癌患者59例(卵巢癌組)，年齡(53.2±17.5)歲(29～72歲)。納入標準：①根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)診斷標準[6]和世界衛(wèi)生組織分級標準[7]，經(jīng)臨床及病理切片檢查確診為上皮性卵巢癌。②入組前未進行手術、放化療等治療。③臨床及隨訪資料完整。排除標準：①合并其它部位腫瘤；②合并心、腎、肝臟嚴重不足；③患有嚴重精神疾??；④妊娠及哺乳期。入組患者根據(jù)病理類型分為漿液性癌38例，粘液性癌11例，內(nèi)膜樣腺癌7例，透明細胞癌3例；根據(jù)組織學分級分為G1-G2期級26例，G3期級33例；根據(jù)FIGO分期分為Ⅰ-Ⅱ期28例，Ⅲ-Ⅳ期31例。另選同期卵巢上皮性囊腺瘤患者47例為良性腫瘤組，年齡(52.83±17.34)歲(28～70歲)；漿液性囊腺瘤32例，黏液性囊腺瘤15例。所有患者均對本研究知情并簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準同意。

1.2 主要儀器與試劑

免疫組織化學染色試劑盒(德國Roche公司)、鼠抗人GSDMD多克隆抗體(臺灣Abnova公司)、鼠抗人Caspase-4多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)、羊抗鼠IgG二抗(上海研卉生物科技有限公司)。

1.3 檢測方法

1.3.1樣本采集術中收集卵巢癌組患者癌組織、癌旁組織(距病灶>5cm)及良性腫瘤組患者瘤組織。經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋后制成4μm厚切片備用。

1.3.2 GSDMD、Caspase-4蛋白表達檢測采用免疫組織化學染色法檢測組織中GSDMD、Caspase-4蛋白表達水平。嚴格按照免疫組化染色試劑盒說明書進行操作，最終所得切片在顯微鏡下觀察并采集圖像信息。每張切片選取6個高倍鏡視野進行陽性細胞計數(shù)，GSDMD、Caspase-4蛋白在細胞質、細胞核中呈棕黃色或棕褐色的細胞為陽性細胞。染色結果評分根據(jù)陽性細胞染色程度和陽性細胞百分比記分，陽性細胞染色程度不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞百分比<5%為0分，5～25%為1分，25～50%為2分，50～75%為3分，>75%為4分。兩項記分相加≤3分為低表達，>3分為高表達。

1.4 隨訪

卵巢癌組患者經(jīng)治療出院后均以電話或復查形式隨訪5年，時間截止至2019年9月，隨訪期間無失訪。隨訪期間記錄患者生存情況。

1.5 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料用(%)表示，行χ2檢驗。繪制Kaplan-Meier生存曲線進行生存分析，行Log-rank檢驗。用Cox回歸模型進行危險因素分析，采用向后剔除法，行LR檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1GSDMD、Caspase-4蛋白表達水平

如表1、圖1(855頁)所示，GSDMD、Caspase-4蛋白主要表達于細胞核、細胞質中。GSDMD、Caspase-4蛋白高表達率卵巢癌組織中最低、良性腫瘤組織居中、癌旁正常組織中最高(均P<0.05)。

表1 不同組織中GSDMD、Caspase-4蛋白表達水平(例)

2.2 卵巢癌組織中GSDMD、Caspase-4蛋白表達與臨床病理特征關系

不同GSDMD、Caspase-4蛋白表達水平患者其年齡、腫瘤直徑、病理類型、有無腹水等比較均無差異(P>0.05)。組織學分級G3級、FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、淋巴結轉移患者GSDMD、Caspase-4蛋白高表達率低于組織學分級G1-G2級、FIGO分期Ⅰ-Ⅱ期、無淋巴結轉移患者(P<0.05)。見表2。

表2 卵巢癌組織中各蛋白表達與臨床病理特征關系

2.3 卵巢癌組織中GSDMD、Caspase-4表達相關性

如表3所示，上皮性卵巢癌組織中GSDMD與Caspase-4蛋白表達水平呈正相關(P<0.05)。

表3 上皮性卵巢癌組織中GSDMD、Caspase-4蛋白表達水平相關性

2.4 不同GSDMD、Caspase-4蛋白表達水平卵巢癌患者生存分析

經(jīng)5年隨訪，GSDMD低表達患者累積生存6例，GSDMD高表達患者累積生存13例，GSDMD低表達組5年總生存率(17.1%)低于GSDMD高表達患者(54.2%)(P<0.05)。Caspase-4低表達患者累積生存8例，Caspase-4高表達患者累積生存11例，Caspase-4低表達組患者5年總生存率(21.1%)低于Caspase-4高表達總生存率(52.4%)。見圖2(855頁)。

2.5 影響卵巢癌患者不良預后危險因素

如表4所示，Cox回歸模型單因素分析顯示，組織學分級G3、FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、淋巴結轉移、GSDMD低表達、Caspase-4低表達是影響上皮性卵巢癌患者不良預后發(fā)生的危險因素(P<0.05)。Cox回歸模型多因素分析顯示，F(xiàn)IGO分期Ⅲ-Ⅳ期、淋巴結轉移、GSDMD低表達、Caspase-4低表達是影響上皮性卵巢癌患者不良預后發(fā)生的獨立危險因素(P<0.05)。

表4 影響上皮性卵巢癌患者不良預后危險因素分析

3 討論

上皮性卵巢癌早期患者難以發(fā)現(xiàn)或重視，當出現(xiàn)消瘦、食欲減退、腹水增加等癥狀時病情已進展至晚期。晚期患者經(jīng)治療后病情難以控制，死亡率較高[1]。因此探尋上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中調控因子對及時了解患者病情進展、給予有效治療有一定幫助。

GSDMD屬于Gsdermin家族，是細胞焦亡過程中的效應蛋白。炎性細胞因子可誘導GSDMD裂解，使細胞膜形成活性空隙，通過改變細胞膜通透性使細胞裂解死亡[8]。有研究表明，感染性疾病進展中機體可通過激活炎性小體促進GSDMD分解和IL-18等炎性因子成熟，促使細胞膜破裂，達到清除感染細胞、完成免疫應答過程目的[9]。近年來GSDMD在腫瘤疾病進展中意義也多有研究。Yang等研究報道，在子宮內(nèi)膜癌模型小鼠體內(nèi)補充氫可通過誘導組織及細胞系中GSDMD過表達激活焦亡通路，抑制腫瘤體積和質量增大[10]。本研究結果顯示，上皮性卵巢癌組織中GSDMD蛋白高表達率明顯低于卵巢良性腫瘤組織及癌旁正常組織，良性腫瘤組織中GSDMD蛋白高表達率低于癌旁正常組織，與Yang等[10]子宮內(nèi)膜癌研究趨勢一致，提示GSDMD蛋白表達水平變化可能與上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展有關。Kambara等研究證實，GSDMD可誘導中性粒細胞和巨噬細胞裂解死亡，發(fā)揮抗菌抗炎作用[11]。Teng等研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD過表達可能受NLRP3炎癥小體誘導激活細胞焦亡，抑制非小細胞肺癌細胞增殖、促進凋亡[12]。提示上皮性卵巢癌進展中GSDMD低表達可能與其誘導細胞焦亡減弱有關。本研究還發(fā)現(xiàn)，與組織學分級G1-G2級、FIGO分期Ⅰ-Ⅱ期、無淋巴結轉移患者相比，組織學分級G3級、FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、淋巴結轉移患者GSDMD蛋白高表達率明顯降低，提示GSDMD蛋白高表達率降低可能與組織學分級、FIGO分期升高、淋巴結轉移等腫瘤進展有關。

Caspase-4屬于半胖氨酸蛋白酶家族，與細胞炎癥性程序性死亡過程密切相關。有研究報道，膿毒癥進展中微生物病原體侵入使機體產(chǎn)生由Caspase-4等組成的炎癥小體結構以啟動危險信號響應，炎癥小體促使感染細胞發(fā)生焦亡[13]。Caspase-4在腫瘤進展中也發(fā)揮重要作用。有研究報道，結腸癌細胞中Caspase-4表達下調，上調其表達可誘導癌細胞DNA損傷，促進癌細胞凋亡[14]。本研究結果顯示，癌旁正常組織、上皮性卵巢良性腫瘤組織、上皮性卵巢癌組織中Caspase-4蛋白高表達率依次顯著降低，提示Caspase-4蛋白低表達可能預示上皮性卵巢癌發(fā)生，Caspase-4表達下調可能與炎癥小體誘導的細胞焦亡減弱、癌細胞侵襲能力增大有關。有研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-4在原發(fā)性肝癌患者血清中低表達，與腫瘤惡性程度和治療效果有關[15]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，組織學分級G3級、FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、淋巴結轉移患者Caspase-4蛋白高表達率明顯低于組織學分級G1-G2級、FIGO分期Ⅰ-Ⅱ期、無淋巴結轉移患者，提示Caspase-4蛋白表達下調可能與上皮性卵巢癌患者組織學分級、FIGO分期升高及淋巴結轉移發(fā)生密切相關。

有研究證實，GSDMD作為Caspase-4底物參與細胞焦亡過程[5]。Shi等研究報道，Caspase-4對GSDMD特異性誘導轉化作用是細胞焦亡發(fā)生、炎性壞死和程序性壞死的必要途徑[16]。Qiao等研究報道，α-NETA可能通過促進GSDMD/Caspase-4轉換抑制卵巢上皮細胞增殖分化[17]。本研究結果顯示，上皮性卵巢癌組織中GSDMD與Caspase-4蛋白表達水平呈正相關，提示GSDMD與Caspase-4間可能存在相互作用，共同參與上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展；GSDMD、Caspase-4低表達組5年總生存率低于GSDMD高表達組，且FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、淋巴結轉移、GSDMD低表達、Caspase-4低表達是影響上皮性卵巢癌患者不良預后發(fā)生的獨立危險因素，進一步提示GSDMD、Caspase-4低表達與腫瘤進展及患者生存率低等不良預后發(fā)生有關，可能對臨床治療效果及預后判斷有一定幫助。

綜上所述，上皮性卵巢癌組織中GSDMD、Caspase-4蛋白高表達率顯著降低，與組織學分級G3級、FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、淋巴結轉移等腫瘤進展及患者5年總生存率低等不良預后發(fā)生密切相關。二者可能存在相互作用，共同參與上皮性卵巢癌進展。但由于本研究方法較為基礎，具體機制驗證還需進一步探究。